Desarrollo de estrategias biotecnológicas destinadas a la generación de células eritroides in vitro a partir de células madre/progenitoras hematopoyéticas derivadas de sangre de cordón umbilical

Abstract

Las células del linaje eritroide tienen potencial aplicación en terapia celular, entrega y análisis de drogas e identificación de pares de transfusión e individuos aloinmunizados. Actualmente su producción ex vivo a partir de células madre hematopoyéticas (HSPCs) no es rentable, lo que impide su empleo en transfusiones y limita otros usos. El objetivo fue desarrollar estrategias para generar células eritroides a partir de HSPCs de sangre de cordón umbilical, reduciendo el uso de factores de crecimiento, principales contribuyentes al costo del medio de cultivo. Se aplicaron diseños experimentales para optimizar la formulación del medio de expansión de HSPCs. Un diseño Placket-Burman permitió determinar efectos significativos de la BSA, GM-CSF e hidrocortisona. Sus concentraciones óptimas fueron 2%(P/V), 20 ng/ml y 0,00004 M, respectivamente, aplicando un diseño Box‑Behnken. Se cultivaron HSPCs en estas condiciones y luego en medio reportado de expansión/maduración eritroide. Se evidenció expansión y diferenciación eritroide progresiva y selectiva, mediante análisis inmunofenotípico, morfológico y UFC. Adicionalmente, se hipotetizó que la transgenesis lentiviral con el gen de hEPO permitiría que las células la produzcan, disminuyendo su utilización como suplemento. Tanto las HSPCs transducidas cultivadas sin EPO comercial [eHSPCs-EPOc(-)], como aquéllas no modificadas cultivadas con EPOc [nmHSPCs-EPOc(+)] alcanzaron similar maduración, con compromiso eritroide, evidenciado por un incremento de células CD71+ y CD235a+ y cambios morfológicos. La detección de hEPO secretada en sobrenadantes de eHSPCs-EPOc(-) demostró que ésta indujo la diferenciación. Además las nmHSPCs‑EPOc(-) no mostraron compromiso eritroide. Ambas estrategias son intersantes para mejorar los procesos de producción ex vivo de células eritroides.

Erythroid lineage cells have potential application in cell therapy, drug delivery and screening, and identification of transfusion matches or alloimmunized individuals. However, the available protocols for their ex vivo production from hematopoietic stem cells (HSPCs) are not cost-effective, which prevents their utilization in transfusional practices and limits other uses. The aim was to develop strategies to generate erythroid cells from umbilical cord blood HSPCs, reducing growth factors utilization, as they are the main contributors to the culture medium cost. Experimental designs were applied to optimize the HSPCs expansion medium formulation. Plackett-Burman design allowed identifying that BSA, GM-CSF and hydrocortisone have significant effects over expansion. Their optimal concentrations were 2%(W/V), 20 ng/ml and 0,00004 M, respectively, after applying a Box-Behnken design. After expansion in these conditions, HSPCs were cultured in a reported erythroid expansion/maturation medium. 571-fold expansion and progressive and selective erythroid differentiation were evidenced by immunophenotypic, morphological, hemoglobin and CFU analyses. Additionally, it was hypothesized that lentiviral transgenesis with the erythropoietin (hEPO) gene would make cells produce hEPO, diminishing its utilization as supplement. Both transduced HSPCs cultured without commercial EPO [eHSPCs-EPOc(-)] and non-modified cells cultured with EPOc [nmHSPCs-EPOc(+)], reached similar maturation states, with erythroid commitment, as percentages of CD71+ and CD235a+ cells increased and morphological changes were evidenced. eHSPCs-EPOc(-) differentiation was shown to be induced by secreted hEPO, which was detected by ELISA and western blotting. Furthermore, nmHSPCs-EPOc(-) controls did not show erythroid commitment. Both approaches are interesting to improve the biotechnological processes intended for ex vivo erythroid cells production.