Esta tesis profundiza el estudio comparativo del metabolismo de los hidratos de carbono entre organismos heterótrofos y autótrofos. Para tal caso, se abordó el estudio in vitro de las enzimas que conforman las rutas biosintéticas del glucógeno en dos bacterias: Prevotella intermedia (quimioorgano-heterótrofo) y Nitrosomonas europaea (quimiolito-autótrofo). Para esta última, además se profundizó en la comprensión del metabolismo de la sacarosa, usualmente ausente en organismos procariotas no fotosintéticos. En este trabajo se clonó, purificó y caracterizó las enzimas recombinantes glucógeno sintasa y dTDP-glucosa pirofosforilasa de Prevotella intermedia y la glucógeno sintasa, ADP-glucosa pirofosforilasa, sacarosa sintasa, sacarosa-fosfato sintasa de Nitrosomonas europaea. Nuestros resultados proponen que la síntesis de glucógeno en Prevotella intermedia podría llevarse a cabo por una variante de la vía clásica procariota, en la que la glucosa-1-fosfato se activaría como dTDP-glucosa y este funcionaría como sustrato para elongar glucógeno a través de la enzima glucógeno sintasa. En Nitrosmonas europaea en cambio, la síntesis de glucógeno sería a través de la vía clásica encontradas en la mayoría de las bacterias y plantas. La enzima ADP-glucosa pirofosforilasa fue activada por piruvato, oxaloacetato y fosfoenolpiruvato e inhibida por AMP, cómo así también mostró una marcada promiscuidad por el uso del cofactor metálico divalente (Mg2+, Co2+, Mn2+ y Cd2+) y los NTPs y el azucar-1-fosfato. A diferencia de lo que ocurre en plantas y cianobacterias, la síntesis de sacarosa sería vía ADP-glucosa en vez de UDP-glucosa y el metabolismo del glucógeno y la sacarosa estarían altamente vinculados en esta bacteria.
The thesis explores the comparative study of carbohydrate metabolism between heterotrophic and autotrophic organisms. With that purpose, we performed the in vitro study of enzymes that make up the glycogen biosynthetic pathways of two bacteria: Prevotella intermedia (chemoorgano-heterotroph) and Nitrosomonas europaea (chemolitho-autotroph). For the latter, we also deepened in understanding the sucrose metabolism, usually absent in non-photosynthetic prokaryotes. In this work we expressed, purified, and characterized the recombinant enzymes glycogen sinthase y dTDP-glucose pyrophosphorylase from Prevotella intermedia and glycogen synthase, ADP-glucose pyrophosphorylase, sucrose synthase and sucrose-phosphate synthase from Nitrosomonas europaea. Our results, propose that Prevotella intermedia glycogen synthsis could be carried out by a variation of the classical prokaryote pathway, where the glucose-1-phosphate may be activated as dTDP-glucose and this substrate be used as substrate by glycogen synthase to elongate glycogen. Instead, Nitrosomonas europaea could synthesize glycogen using the classical pathway founded in prokaryotes and plants. The ADP-glucose pyrophosphorylase enzyme was activated by pyruvate, oxaloacetate and phosphoenolpyruvate and inhibited by AMP; as well as showed promiscuity respect the essential divalent metal cofactors (Mg2+, Co2+, Mn2+ and Cd2+) and the nucleotide triphosphate and sugar-1-phosphate substrate usage. Unlike ocurre in plants and cyanobacteria, the sucrose synthesis may occure by the ADP-glucose substrate, instead UDP-glucose, and the glycogen and sucrose metabolism linkage could be established at Nitrosmonas europaea.
