Estudio de estructura-función y regulación en enzimas del metabolismo del carbono y de la generación del poder reductor en células autótrofas

Abstract

Euglena gracilis es un protista unicelular fotosintético capaz de crecer en condiciones auto-, hetero- y mixotróficas, sintetizando diversos bioproductos de interés, entre ellos el polisacárido de reserva paramilon, un beta-1,3-glucano, que presenta especial interés ya que se ha descripto como inmunoestimulante y bioactivo como antimicrobiano. En este contexto, se realizaron estudios en E. gracilis, relacionados a la partición del carbono en cuanto a la síntesis y degradación del paramilon. Abordando el análisis bioquímico de la UDP-glucosa pirofosforilasa (EC 2.7.7.9; UDP-Glc PPasa), la UDP-azúcar pirofosforilasa (EC 2.7.7.64; UDP-azúcar PPasa), la paramilon sintasa (EC 2.4.1.34; PS) y una beta-1,3-glucanasa de la familia de glicosil hidrolasa 17 (EC 3.2.1.39; GH17). Se caracterizaron los cultivos crecidos en diferentes condiciones evaluando la acumulación de paramilon. Se caracterizó en forma cinética, estructural y regulatoria a la UDP-Glc PPasa recombinante. Además de su funcionalidad in vivo mediante silenciamiento en la célula evaluándola conjuntamente a la UDP-azúcar PPasa. La PS, elonga el beta-1,3-glucano y al encontrarse anclada a la membrana que rodea al granulo de paramilon, se la utilizó en el diseño de una herramienta de marcación subcelular mediante anticuerpos policlonales. Para la degradación del paramilon influyen diferentes beta-1,3-glucanasas habiendo analizado la funcionalidad in vivo por silenciamiento de esta GH17. Además, la GH17 recombinante hidrolizó tanto el paramilon, como la laminarina siendo 3 veces menos eficiente por el primero. Así, los estudios in vitro se complementaron con análisis in vivo, permitiendo en conjunto aportar al conocimiento respecto al metabolismo del carbono en esta microalga fotosintética Euglena gracilis.

Euglena gracilis is a photosynthetic unicellular protist, capable of growing under auto-, hetero- and mixotrophic conditions. E. gracilis can synthesize several bioproducts of interest including paramylon, a reserve polysaccharide. It is a beta-1,3-glucan, which has a special interest since it has been described as immunostimulant and bioactive as antimicrobial. Studies on E. gracilis, related to carbon partition in terms of synthesis and degradation of paramylon were executed. In this context, a biochemical analysis of UDP-glucose pyrophosphorylase (EC 2.7.7.9; UDP-Glc PPase), UDP-sugar pyrophosphorylase (EC 2.7.7.64; UDP-sugar PPase), paramylon synthase (EC 2.4.1.34; PS) and a beta-1,3-glucanase of the glycosyl hydrolase family 17 (EC 3.2.1.39; GH17) were carried out. E. gracilis cells grown under different conditions were characterized by assessing paramylon accumulation. The recombinant UDP-Glc PPase was characterized in a kinetic, structural and regulatory manner. On the other hand, functionality was analyzed in vivo by silencing. In addition, the functionality of the UDP-sugar PPase was analyzed together to UDP-Glc PPase. The PS, elongate the beta-1,3-glucan and as it is anchored to membrane surrounding paramylon granules. It was used in the design of a subcellular labeling tool using polyclonal antibodies. Different beta-1,3-glucanases influence paramylon degradation. Functionality, in vivo, GH17 was analyzed by silencing its translation. In addition, recombinant GH17 hydrolyzed both, paramylon and laminarin, being 3 times less efficient with first one. Thus, in vitro studies were complemented with in vivo analysis, allowing together to contribute on knowledge regarding carbon metabolism in this photosynthetic microalgae Euglena gracilis.