14 alfa esterol demetilasa de Rhizopus arrhizus (syn. Rhizopus oryzae): participación en la resistencia natural a voriconazol

Abstract

Rhizopus oryzae es el principal agente causal de la mucormicosis. Actualmente, no existe un tratamiento totalmente efectivo para estas micosis, debido a que estos hongos son resistentes a la mayoría de los antifúngicos y a la toxicidad del principal tratamiento disponible, anfotericina B (AMB). Como un intento de resolver esta problemática, nos planteamos en este trabajo estudiar los mecanismos moleculares de resistencia de R. oryzae al voriconazol y evaluar nuevas opciones terapéuticas. Se demostró que la secuencia codificante del gen RoCYP51A es la única responsable de los patrones de sensibilidad a azoles de R. oryzae. Se comprobó que la sustitución natural F129Y en la Cyp51Ap tiene implicancia en la resistencia a voriconazol y en la sensibilidad reducida a posaconazol. En cuanto a la búsqueda de alternativas terapéuticas, se evaluó la actividad in vitro de ocho drogas, solas y en combinación con voriconazol, frente a 25 cepas de Mucorales. AMB y posaconazol fueron las drogas más activas cuando se evaluaron solas. Para algunos aislamientos se observó al microscopio alteraciones en el desarrollo de la hifa (AH) cuando se enfrentaron a las combinaciones de drogas. Utilizando un modelo de mucormicosis en Galleria mellonella, se observó una mejor supervivencia en los tratamientos combinados de VRC con AMB y con caspofungina, en comparación con AMB sola para R. microsporus. Esa mayor supervivencia se obtuvo utilizando una dosis de AMB 32 veces menor cuando se combinó con voriconazol que cuando se usó sola. Estas dosis antifúngicas emulan las concentraciones antifúngicas donde se observaron las AH.

Rhizopus oryzae is the most prevalent causative agent of mucormicosis. Currently, there is no fully effective treatment for these mycoses, since these fungi are resistant to most of the available antifungals. The toxicity of the main available treatment (amphotericin B (AMB)) is another important problem. As an attempt to solve this problem, we propose to study the molecular mechanisms of resistance of R. oryzae to voriconazole and evaluate new therapeutic options. We demonstrated that the coding sequence of the RoCYP51A gene is solely responsible for the azole sensitivity patterns of R. oryzae. The natural substitution F129Y in Cyp51Ap was shown to have an implication in resistance to voriconazole and in reduced sensitivity to posaconazole. Regarding the search for therapeutic alternatives, the in vitro activity of eight drugs, alone and in combination with voriconazole, was evaluated against 25 Mucoral strains. AMB and posaconazole were the most active drugs when evaluated alone. Microscopic alterations in the development of hypha were observed for some isolates when confronted against drugs combinations. Using a Galleria mellonella mucormycosis model, better survival was observed in the combined treatments of voriconazole with AMB and with caspofungin, compared to AMB alone for R. microsporus. This greater survival was obtained using a 32 times lower dose of AMB when combined with voriconazole than when used alone. These lower antifungal doses emulate the antifungal concentrations where microscopic alterations of hyphae were observed.