Caracterización de sistemas de regulación por modificaciones postraduccionales de proteínas de la partición del carbono en células vegetales

Abstract

La fosfoenolpiruvato (PEP) carboxiquinasa dependiente de ATP (PEPCKasa, EC 4.1.1.49) es una enzima citosólica que cataliza la descarboxilación reversible del oxaloacetato a PEP. En plantas, esta enzima posee múltiples funciones: i) es parte de los mecanismos de concentración del CO2 que operan en la fotosíntesis C4 y CAM, ii) participa en las respuestas al estrés biótico y abiótico, iii) está involucrada en el metabolismo del nitrógeno y de los aminoácidos y iv) juega un rol clave en la gluconeogénesis. En esta Tesis, estudiamos las PEPCKasas presentes en Arabidopsis thaliana: la AthPEPCKasa1 (At4g37870) y la AthPEPCKasa2 (At5g65690). Realizamos la caracterización cinética, estructural y regulatoria de las proteínas recombinantes expresadas en Escherichia coli. Describimos la regulación alostérica de estas enzimas por metabolitos y dipéptidos. También estudiamos la regulación postraduccional de la AthPEPCKasa1 por proteólisis, óxido reducción y fosforilación. En todos los casos, los resultados se discutieron en un escenario metabólico. Por otra parte, se desarrolló un método fluorométrico para medir actividad quinasa de proteínas. También clonamos y la caracterizamos las quinasas de proteína recombinantes SnRK1 de Arabidopsis thaliana y SOS2 de Malus domestica. Además, estas quinasas se utilizaron para estudiar la fosforilación de enzimas involucradas en el metabolismo del carbono en plantas. En conjunto, los resultados obtenidos en esta Tesis profundizaron el conocimiento sobre la regulación del metabolismo del carbono en plantas por mecanismos postraduccionales. Anticipamos que nuestros resultados abrirán nuevas perspectivas en la regulación del metabolismo vegetal, en especial en la gluconeogénesis y la síntesis de azúcares alcoholes.

ATP-dependent phosphoenolpyruvate (PEP) carboxykinase (PEPCK, EC 4.1.1.49) is a cytosolic enzyme that catalyzes the reversible decarboxylation of oxaloacetate to PEP. In plants, this enzyme has multiple functions: i) is part of the mechanisms of CO2 concentration operating in C4 and CAM photosynthesis, ii) participates in biotic and abiotic stress responses, iii) is involved in nitrogen and amino acids metabolisms, and iv) plays a crucial role in gluconeogenesis. In this Thesis, we studied in detail the PEPCKs present in Arabidopsis thaliana: AthPEPCK1 (At4g37870) and AthPEPCK2 (At5g65690). We performed the kinetic, structural, and regulatory characterization of the recombinant proteins expressed in Escherichia coli. We described the allosteric regulation of these enzymes by metabolites and dipeptides. Also, we studied the post-translational regulation of AthPEPCK1 by proteolysis, oxidation-reduction, and phosphorylation. In all cases, the results obtained were discussed in a metabolic scenario. On the other hand, we developed a fluorometric assay to measure protein kinase activity. Also, we cloned and characterized the recombinant protein kinases SnRK1 from Arabidopsis thaliana and SOS2 from Malus domestica. These kinases were then employed to study the phosphorylation of enzymes involved in plant carbon metabolism. Altogether, the results obtained in this Thesis deepen the knowledge regarding the regulation of carbon metabolism in plants by post-translational modifications. We anticipate that our results will open new perspectives on plant metabolism regulation, especially for gluconeogenesis and the synthesis of sugar alcohols.