Desarrollo de una tecnología de producción de interferón alfa humano recombinante glicosilado en células eucariontes

Abstract

El interferón alfa humano comprende una familia de proteínas que bloquean la infección viral e inhiben la proliferación celular. La citoquina producida en bacterias se encuentra aprobada para su uso clínico en el tratamiento de diversas patologías, siendo el principal problema su rápida eliminación del torrente sanguíneo. En el presente trabajo de Tesis se desarrolló exitosamente una estrategia de glicoingeniería mediante la introducción de sitios potenciales de N-glicosilación en la secuencia aminoacídica del rhIFNalfa2b, lo que permitió incrementar su vida media plasmática y, en consecuencia, su actividad biológica in vivo. Inicialmente, se seleccionaron las mutaciones más adecuadas para construir derivados del rhIFNalfa2b con un número variable de sitios de N-glicosilación. Conforme al aumento del número de sitios incorporados, se observó un incremento progresivo de la masa molecular de las muteínas. Por otra parte, la actividad biológica específica antiviral y antiproliferativa de las mismas disminuyó gradualmente en forma concomitante con la adición de sitios consenso. La farmacocinética de todas las variantes del rhIFNalfa2b en ratas demostró un incremento del tiempo de vida media y una disminución del clearance plasmático en forma concomitante con el agregado de sitios de N-glicosilación. De esta manera, el IFN con cuatro sitios de glicosilación (IFN4N) exhibió una vida media 25 veces superior y un clearance 20 veces inferior con respecto a la molécula no modificada. Además, a pesar de su menor actividad biológica in vitro, el IFN4N demostró un marcado incremento de su actividad antitumoral in vivo, determinada como su capacidad de inhibir el crecimiento de tumores en ratones inmunocomprometidos.

Human alpha interferons comprise a family of closely related proteins that block viral infection and inhibit cell proliferation. Bacterially produced hIFNalpha2b has been approved for the treatment of a great variety of human diseases, but the clinical use of this cytokine has been restricted due to its short circulating half life. In the present Thesis work a successful glycoengineering strategy was developed through the introduction of potential N-glycosylation sites in the rhIFNalpha2b amino acid sequence, which allowed us to increase the cytokine´s plasma half-life and, in turn, its in vivo biological activity. Taking into account the carbohydrate content and the preservation of the biological activity, five amino acid mutations were chosen to construct rhIFNalpha2b derivatives with a variable number of N-glycosylation sites. Successive increases in size were observed after each addition of a functional consensus sequence. On the other hand, antiviral biological activity of rhIFNalpha2b was gradually reduced with the incorporation of new glycosylation sites. Pharmacokinetic experiments showed a 25-fold increase in the elimination half life and a 20-fold decrease in the systemic clearance rate of the IFN variant with four N-glycosylation sites (4N-IFN) compared to the non-glycosylated rhIFNalpha2b following subcutaneous administration to rats. Moreover, in spite of its lower in vitro activity, 4N-IFN showed a markedly enhanced in vivo antitumor activity in human prostate carcinoma implanted in nude mice.