Desarrollo de herramientas moleculares para estrategias de biorefinería: Obtención, purificación y caracterización funcional de enzimas recombinantes para la degradación de lignocelulosa

Abstract

La biomasa lignocelulósica representa una excelente fuente para la producción de biocombustibles y bioproductos de manera ecológica y sustentable, pero sus características estructurales hacen que sea recalcitrante a la degradación. Sin embargo, diversas enzimas son capaces de llevar a cabo este proceso a partir de la complementariedad de su actividad. En este trabajo de Tesis se caracterizaron bioquímica y estructuralmente enzimas involucradas en la degradación de la lignocelulosa pertenecientes a Ruminococcus albus 8. Específicamente, la caracterización de RalCel5G evidenció un modo de acción de endoglucanasa procesiva. El empleo de esta enzima en simultaneo con la celobiohidrolasa RalCel48A evidenció un efecto sinérgico en la degradación de la celulosa. Por su parte, en la caracterización de la xilanasa GH10 (RalXyn10A) se detectó un dominio N-terminal particular, asociado la regulación redox de la actividad enzimática y a la interacción con sustratos. La aplicación de esta hemicelulasa en combinación con RalCel5G y RalCel48A mostró un incremento sustancial en la capacidad de hidrólisis de sustratos lignocelulósicos complejos. Finalmente, las glicosil fosforilasas RalCBP y RalCDP, mostraron elevada actividad con monosacáridos y oligosacáridos, respectivamente. La eficiencia de cada una de ellas fue mejorada a partir de la eliminación del dominio N-terminal o la fusión de un CBM, respectivamente. Los avances logrados en el conocimiento de estas enzimas y sobre los mecanismos de acción e interacciones con los diferentes sustratos, facilitan el desarrollo de diversas aplicaciones biotecnológicas tales como la producción de biocombustibles, biopolímeros y/u otros materiales.

Lignocellulosic biomass represents an excellent source for the production of biofuels and bioproducts in an ecological and sustainable manner, but its structural characteristics make it recalcitrant to degradation. However, various enzymes are capable of carrying out this process based on the complementarity of their activity. In this Thesis work, enzymes involved in the degradation of lignocellulose belonging to Ruminococcus albus 8 were biochemically and structurally characterized. Specifically, the characterization of RalCel5G revealed a processive endoglucanase mode of action. The employment of this enzyme simultaneously with the cellobiohydrolase RalCel48A showed a synergistic effect on the degradation of cellulose. During the characterization of xylanase GH10 (RalXyn10A) a particular N-terminal domain was detected, associated with the redox regulation of the enzymatic activity and the interaction with substrates. The application of this hemicellulase in combination with RalCel5G and RalCel48A showed a substantial increase in the hydrolytic capacity of complex lignocellulosic substrates. Finally, the glycosyl phosphorylases RalCBP and RalCDP showed high activity with monosaccharides and oligosaccharides, respectively. The efficiency of each one was improved from the elimination of the N-terminal domain or the fusion of a CBM, respectively. The advances achieved in the knowledge of these enzymes and the action mechanism and interactions with the different substrates, facilitate the development of various biotechnological applications such as the production of biofuels, biopolymers and/or other materials.