Estudio, caracterización y evaluación de formulaciones liposomales de Anfotericina B

Abstract

Una terapia de probada eficacia para tratar infecciones fúngicas invasivas consiste en la administración intravenosa de Anfotericina B (AmB), sin embargo, este antibiótico presenta una ventana terapéutica reducida debido a su toxicidad y es por ello que desde hace algún tiempo se lo utiliza en formulaciones liposomales. La efectividad de estas formulaciones resulta ser muy dependiente no solo de su composición lipídica sino también de su técnica de producción debido a cambios fisicoquímicos todavía no esclarecidos que ocurren en el proceso de fabricación. Por otra parte, el mecanismo de acción de AmB a nivel molecular sigue siendo difícil de dilucidar. AmB no solo se utiliza por vía intravenosa, sino también para el tratamiento de infecciones dérmicas, como la leishmaniasis cutánea. Sin embargo, no existen en el mercado local formulaciones disponibles de AmB para uso dérmicoEste proyecto se presenta como una colaboración entre un grupo de investigación de la FBCB con amplia trayectoria en el estudio de vesículas lipídicas y membranas biológicas; y una empresa local (Lipomize SRL) con amplia trayectoria en el desarrollo de formulaciones liposomales. Tanto la FBCB como la empresa Lipomize SRL cuentan con el equipamiento necesario para llevar a cabo los objetivos propuestosSe plantean dos objetivos principales: 1) la caracterización de los procesos fisicoquímicos que ocurren en las diferentes etapas de producción de una formulación liposomal de AmB para administración intravenosa (LIV); y 2) la formulación y caracterización fisicoquímica de un fármaco de AmB para uso dérmico (LUD)Sobre la formulación LIV nos proponemos determinar, mediante espectroscopía de EPR, UV-Vis y de fluorescencia, la dinámica de agregación de los monómeros de AmB tanto en solución como aquellos que se encuentran incorporados a la bicapa lipídica de los liposomas, y estudiar el efecto del fármaco sobre la membrana eritrocitaria en cuanto a su permeabilidad y a su ordenamiento de la bicapa lipídicaEn cuanto a la formulación LUD, nos proponemos ensayar y evaluar una serie de formulaciones lipídicas acordes a la vía de administración del fármaco; caracterizar mediante DLS, espectroscopía de EPR, UV-Vis y Fluorescencia los productos intermedios en cada etapa de producción con el objetivo de entender los procesos fisicoquímicos involucrados; y establecer las condiciones experimentales adecuadas para llevar adelante el proceso de gelificación en la etapa final del proceso de producción

The treatment of fungal diseases constitutes a very relevant aspect of public health, particularly in developing countries such as Argentina. A proven effective therapy to treat invasive fungal infections consists of the intravenous administration of Amphotericin B (AmB), however, this antibiotic has a reduced therapeutic window due to its toxicity and that is why it has been used in liposomal formulations. The effectiveness of these formulations turns out to be very dependent not only on the lipid composition but also on their production technique due to still unclarified physicochemical changes that occur in the manufacturing process. Although AmB has been used clinically for several decades, the mechanism of action at the molecular level remains difficult to elucidate, and several models have been proposed. AmB is not only used intravenously, but also for the treatment of dermal infections, such as cutaneous leishmaniasis. However, there are no available formulations of Amphotericin B for dermal use in the local market. This project is presented as an interdisciplinary collaboration between a FBCB research group with extensive experience in various methodologies for studying lipid vesicles and biological membranes using different spectroscopic techniques; and a local company (Lipomize SRL) with extensive experience in the development of liposomal formulations. Both the FBCB and the company Lipomize SRL have the necessary equipment to carry out the proposed objectives. Two main objectives are proposed: 1) the characterization of the physicochemical processes that occur in the different stages of production of a liposomal formulation of Amphotericin B for intravenous administration that Lipomize SRL has already managed to formulate; and 2) the formulation and physicochemical characterization of an Amphotericin B drug for dermal use. For the development of this second part of the project, it is planned to call for a research internship (extracurricular training) and eventually a Bachelor's thesis in Biotechnology. Regarding the liposomal formulation for intravenous use (LIV), we propose to determine, by means of EPR (Electronic Paramagnetic Resonance) with liposoluble spin markers and UV-Vis and fluorescence spectroscopy, the aggregation dynamics of AmB monomers both in solution and those that are incorporated into the lipid bilayer of the liposomes, and to study the effect of the drug on the erythrocyte membrane in terms of its permeability and lipid organization. Regarding the liposomal formulation for dermal use (LUD), we propose to test a limited series of lipid formulations according to the route of administration of the drug in question, and evaluate the relevant characteristics of each of them; characterize by DLS (dynamic light scattering), EPR, UV-Vis and fluorescence spectroscopy the intermediate products at each production stage with the aim of understanding the physicochemical processes involved; and establish the appropriate experimental conditions to carry out the gelation process in the final stage of the production process. Prospectively, and depending on the preliminary results obtained, we also propose an in vitro study of the mechanism of action of the drug in terms of its interaction with the plasma membrane of the target cell, evaluating both its effectiveness and its toxicity. The results obtained will be presented at national and international scientific meetings and will be published in refereed scientific journals.