Nanopartículas de plata funcionalizadas: síntesis, caracterización y desarrollo de un reactivo para western blot

Abstract

El estudio de nanopartículas metálicas, especialmente las de plata (AgNPs), se ha intensificado por sus propiedades físicas, químicas y biológicas. Este proyecto tiene como OBJETIVO GENERAL desarrollar un sistema de revelado para Western Blot (WB), utilizando AgNPs funcionalizadas con anticuerpos anti-receptor de estrógenos alfa (anti-ESR1) conjugados a la enzima peroxidasa de rábano picante (HRP, por sus siglas en inglés). Como HIPÓTESIS DE TRABAJO proponemos que el uso de AgNPs funcionalizadas como reactivo de Western Blot (WB) tendría ventajas respecto a la metodología tradicional. Esta tecnología permitiría amplificar la señal y la sensibilidad en la detección, ya que varias moléculas de anticuerpos primarios pueden unirse a las AgNPs potenciando la detección. Sumado a esto, el uso directo de anticuerpos primarios policlonales que están orientados a epitopes diferentes y conjugados con HRP eliminaría la necesidad de un anticuerpo secundario, acortando el tiempo total del ensayo, contribuyendo a una mayor sensibilidad de la técnica y reduciendo costos. Este proyecto se alinea con el Objetivo de Desarrollo Sostenible (ODS): Salud y Bienestar, ya que tiene un gran potencial en el diagnóstico e investigación de diversas patologías humanas relacionas con ESR1, como aquellas neoplasias estrógeno sensibles. Además, al optimizar las condiciones de síntesis y funcionalización de AgNPs, se establecerá una plataforma versátil para funcionalizar nanopartículas con otros anticuerpos dirigidos a biomoléculas de interés biológico. Esto podría mejorar los inmunoensayos utilizados en el diagnóstico e investigación. De esta manera, el proyecto no solo busca establecer una metodología más eficiente y económica para WB, sino también desarrollar una plataforma adaptable a la funcionalización de AgNPs con diversos anticuerpos, lo que podría mejorar el diagnóstico de diversas enfermedades. OBJETIVOS ESPECÍFICOS •Sintetizar AgNPs por varios métodos: Se utilizarán tres metodologías distintas. Posteriormente se evaluará cuál/es de ellas es la que genera NPs estables y tamaños adecuados (tamaño 20 nm). En la primera metodología, se mezcla una solución de nitrato de plata (AgNO3) y citrato de sodio en agua, agregando posteriormente borohidruro de sodio (NaBH4) a temperatura ambiente, seguido de centrifugación y lavado del precipitado, que se resuspende para su posterior análisis. La segunda metodología replica la primera, pero realiza la adición de NaBH4 a 4°C. La tercera metodología implica la reducción térmica de AgNO3 con citrato de sodio a 90°C, enfriamiento rápido, y agregado de Bromuro de hexadeciltrimetilamonio (CTAB) para evitar la agregación de las AgNPs. •Caracterizar las AgNPs: La morfología de las AgNPs se determinará utilizando microscopía electrónica de transmisión (TEM) utilizando el microscopio electrónico de transmisión JEOL modelo JEM-2100 plus (SECEGRIN, santa Fe). El cálculo del tamaño promedio se hará mediante el análisis de imágenes obtenidas de TEM usando el programa Image J. Se tomarán al menos diez imágenes representativas para cada muestra y se contarán al menos 50 partículas para cada muestra. Además. se hará un barrido espectral entre 300 -500 nm utilizando el espectrofotómetro PerkinElmer Lambda 20 (Departamento de Química General e Inorgánica, FBCB) para identificar el pico de absorción de las AgNPs. Se analizará el radio hidrodinámico de las AgNPs mediante dispersión de Luz Dinámica (DLS, en inglés) a un solo ángulo (900) y Temperatura fija (25 ºC) y se determinará el potencial Z utilizando el equipo Litesizer 500 (INTEC, Santa Fe). •Funcionalizar las AgNPs con anticuerpos conjugados a HRP (Ac-HRP) mediante métodos de adsorción física y de unión covalente: Para la formación de bioconjugados, se utilizarán anticuerpos anti-ESR1 conjugados con HRP (Anticuerpo policlonal de rata, Instituto de Salud y Ambiente del Litoral, CONICET-UNL). En una primera etapa se deberá realizar la conjugación del anticuerpo anti-ESR1 con HRP (Ac-HRP). Para esto, la HRP (Sigma aldrich-Merck, AR) se incubará con una solución de peryodato de sodio en buffer fosfato a T ambiente durante 20 min y luego se harán cambios de buffer con acetato de sodio en tubos Centricon 10K. Se retirará la solución de HRP del Centricón y se agregará a una solución que contenga el anticuerpos anti-ESR1 (en buffer carbonato), incubándose la mezcla durante 2 hs a T ambiente. Posteriormente, se agregará a la mezcla anterior borohidruro de sodio (sólido) y se incubará durante 2 hs a 4 ºC. Finalmente, se realizarán cambios de buffer con PBS en tubos Centricón de 30 K. El producto final se conserva en BSA 1% + timerozal 0,1 %. Una vez obtenido el Ac-HRP, la funcionalización AgNPs se realizará mediante tres protocolos (dos basados en técnicas de adsorción física y uno en conjugación covalente). En los métodos de adsorción física, las AgNPs se incubarán con los anticuerpos en buffer fosfato (pH=7,4) o buffer borato (pH=8), seguido de un proceso de centrifugación en cada caso. En el tercer método,se utilizará ácidomercaptosuccínico para la conjugación covalente, seguido de una incubación a 4°C durante 18 hs, centrifugaciones y lavados para eliminar excesos de anticuerpos con buffer fosfato (pH 7,5). Todas las AgNPs conjugadas se guardarán a 4°C. •Caracterizar lasnanopartículas funcionalizadas (AgNPs-Ac-HRP). La morfología de los AgNPs-Ac-HRP (también denominados bioconjugados) se determinará por TEM, utilizando el microscopio electrónico de transmisión JEOL modelo JEM-2100 plus (SECEGRIN, santa Fe). El cálculo del tamaño promedio de los mismos se llevará a cabo de igual manera como se explicó para las AgNPs. Para identificar el pico de absorción de los bioconjugados se realizará la medición del espectro UV/Vis (entre 300-500 nm) con el espectrofotómetro PerkinElmer Lambda 20. Además, se medirá el radio hidrodinámico de los bioconjugados con el equipo Litesizer 500 (INTEC, Santa Fe). La conjugación efectiva resultaría en un aumento del diámetro entre 15-20 nm en comparación a las AgNPs sin funcionalizar. Para cuantificar la concentración de anticuerpos presentes en las dispersiones de AgNPs-Ac-HRP, se utilizará kit colorimétrico de ensayo de proteínas BCA de Pierce Chemical Co. (Rockford, IL, EE. UU.), utilizando una curva estándar de proteínas (BSA) y midiendo la absorbancia a 560 nm. •Estudiar la estabilidad y funcionalidad de los bioconjugados. Para estudiar la estabilidad de los bioconjugados en el tiempo, se medirá espectrofotométricamente la absorbancia de los mismos a los 0, 1, 15, 30, 60, 90 días. Considerando que el día 0 corresponderá al día en que las AgNPs son funcionalizadas. La longitud de onda de trabajo será seleccionada de acuerdo a resultados previos. Una disminución en la intensidad indicaría formación de agregados y pérdida de estabilidad. Otro parámetro que se analizará es la funcionalidad de las AgNPs-Ac-HRP. Para evaluarlo, se llevará a cabo un ensayo de dot-blot empleando un extracto de proteínas obtenido de un homogeneizado de tejido de rata de la cepa Wistar (útero y ovario). Las muestras detejido de 2 ratas serán obtenidas en el ISAL (Instituto de salud y Ambiente del Litoral, CONICET-UNL). Para este ensayo, se utilizarán membranas de nitrocelulosa, que se bloquearán con PBS-leche al 5%, se lavarán con PBS-Tween 20, y luego se incubarán condistintas diluciones de: a) anticuerpos anti-ESR1-HRP o b) dispersiones AgNPs-ESR1-HRP. Luego de realizar lavados adicionales, se añadirá sustrato de HRP (Luminol Reagent, cat no sc-2048, Santa Cruz Biotechnology, USA). Finalmente, se analizará la presencia de la señal quimioluminiscente utilizando el escáner marca LI –COR, modelo C-DIGIT (Microlat SRL, Argentina). La funcionalidad de las AgNPs-Ac-HRP será verificada al observarse marcación en zona sembrada de la membrana, comparándola con la marcación positiva obtenida para el anticuerpo anti-ESR1. •Optimizar y validar ensayos de WB: La concentración del extracto proteico de tejido de rata se determinará con el kit colorimétrico para determinación de proteínas BCA de Pierce Chemical Co. (Rockford, IL, EE. UU.), según se describió previamente. Una dilución del extracto proteico se sembrará en los geles de acrilamida (4-12 %), se realizarán corridas en cubas electroforéticas y luego electrotransferencia en membranas de nitrocelulosa. Para optimizar el WB, inicialmente se utilizará un protocolo estándar y luego se harán modificaciones en función de los resultados obtenidos. Para el protocolo estándar de WB, las membranas de nitrocelulosa se bloquearán con PBS-leche al 5%, se lavarán con solución tampón Tris con Tween (TBST) y posteriormente se incubarán con las AgNPs-Ac-HRP diluidas en TBST-leche 2% toda la noche a 4 ºC (en agitación). Al día siguiente, la membrana se lavará con TBST y se incubará con substrato para HRP según las especificaciones del fabricante (Luminol Reagent, cat no sc-2048, Santa Cruz Biotechnology, USA). Los pesos moleculares se determinarán por comparación con los estándares de peso molecular (Broad Range Protein Marker, Promega, Biodynamics, Argentina). Para validar el WB, se realizaránlos controles (control positivo, control negativo, etc) y pruebas que sean necesarias para evaluar parámetros como rango lineal de detección, límitede detección, homogenenidad de carga y normalización, según se detalla en el proyecto. •Comparar costos entre el WB tradicional yel método que utiliza AgNPs funcionalizadas: se realizará una estimación de costos teniendo en cuenta: el tiempo de ejecución del ensayo, gastos de reactivos/consumibles y rendimientos, comparando entre ambas metodologías de trabajo.

The study of metallic nanoparticles, especially silver nanoparticles (AgNPs), has intensified due to their physical, chemicaland biological properties. The AIMof this project is to develop a detection system for Western blot (WB) using AgNPs functionalized with anti-estrogen receptor alpha (anti-ESR1) antibodies conjugated to horseradish peroxidase (HRP) enzyme. As a HYPOTHESIS,we propose that the use of functionalized AgNPs as Western Blot (WB) reagent would have advantages over the traditional methodology. This technology would allow amplifying the signal and sensitivity in detection, since several primary antibody molecules can bind to AgNPs enhancing detection. In addition, the direct use of polyclonal primary antibodies that are oriented to different epitopes and conjugated with HRP would eliminate the need for a secondary antibody, shortening the total time of the assay, contributing to a higher sensitivity of the technique and reducing costs. This project is in line with Sustainable Development Goal (SDG): Good Health and Well-Being, as it has great potential in the diagnosis and research of various human pathologies related to ESR1, including estrogen-sensitive cancers. Furthermore, by optimizing the synthesis and functionalization conditions of AgNPs, a versatile platform will be established to functionalize these nanoparticles with other antibodies targeting biological molecules of interest. This could improve immunoassays used in diagnostics and research. The projectaims not only to establish a more efficient and economical methodology for WB, but also to develop a platform adaptable to the functionalization of AgNPs with different antibodies, which could improve the diagnosis of various diseases. SPECIFIC OBJECTIVES Synthesizing AgNPs by several methods: Three different methodologies will be used. Subsequently, it will be evaluated which one/s of them is the one that generates stable NPs and adequate sizes (size 20 nm). In the first methodology, a solution of silver nitrate (AgNO3) and sodium citrate is mixed in water, followed by the addition of sodium borohydride (NaBH4) at room temperature, followed by centrifugation and washing of the precipitate, which is resuspended for further analysis. The secondmethodology replicates the first, but performs the NaBH4 addition at 4°C. The third methodology involves thermal reduction of AgNO3 with sodium citrate at 90°C, rapid cooling, and addition of hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB) to prevent aggregation of AgNPs. To characterize the AgNPs: The morphology of the AgNPs will be determined using transmission electron microscopy (TEM) using a JEOL transmission electron microscope model JEM-2100 plus (SECEGRIN, Santa Fe). The calculation of the average size will bedone by analyzing images obtained from TEM using Image J software. At least ten representative images will be taken for each sample and at least 50 particles will be counted for each sample. In addition. a spectral scan between 300 -500 nm will be performed using PerkinElmer Lambda 20 spectrophotometer (Department of General and Inorganic Chemistry, FBCB) to identify the absorption peak of AgNPs. The hydrodynamic radius of AgNPs will be analyzed by Dynamic Light Scattering (DLS) at a single angle (900) and fixed temperature (25 ºC) and the Z-potential will be determined using the Litesizer 500 (INTEC, Santa Fe). Functionalization of AgNPs with HRP-conjugated antibodies (Ac-HRP) by physical adsorption and covalent binding methods: For the formation of bioconjugates, HRP-conjugated anti-ESR1 antibodies (Rat polyclonal antibody, Instituto de Salud y Ambiente del Litoral, CONICET-UNL) will be used. In a first step, the conjugation of the anti-ESR1 antibody with HRP (Ac-HRP) should be performed. For this, HRP(Sigma aldrich-Merck, AR) will be incubated with a solution of sodium periodate in phosphate buffer at room T for 20 min and then buffer changes will be made with sodium acetate in 10K Centricon tubes. The HRP solution will be removed from the Centricon and added to a solution containing the anti-ESR1 antibody (in carbonate buffer) and the mixture will be incubated for 2 h at room temperature. Subsequently, sodium borohydride (solid) is added to the previous mixture and incubated for 2 h at 4 ºC. Finally, buffer changes are performed with PBS in 30 K Centricon tubes. The final product is preserved in BSA 1% + timerozal 0.1%. Once the Ac-HRP has been obtained, AgNPs will be functionalized using three protocols (two based on physical adsorption techniques andone on covalent conjugation). In the physical adsorption methods, AgNPs will be incubated with the antibodies in phosphate buffer (pH=7.4) or borate buffer (pH=8), followed by a centrifugation process in each case. In the third method, mercaptosuccinic acid will be used for covalent conjugation, followed by incubation at 4°C for 18 h, centrifugation and washing to remove excess antibodies with phosphate buffer (pH 7.5). All conjugated AgNPs will be stored at 4°C. Characterization of functionalized nanoparticles (AgNPs-Ac-HRP). The morphology of the AgNPs-Ac-HRP (also called bioconjugates) will be determined by TEM, using JEOL transmission electron microscope model JEM-2100 plus (SECEGRIN, santa Fe). The calculation of their average size will be carried out in the same way as explained for AgNPs. To identify the absorption peak of the bioconjugates, the UV/Vis spectrum (between 300-500 nm) will be measured with the PerkinElmer Lambda 20 spectrophotometer. In addition, the hydrodynamic radius of the bioconjugates will be measured with the Litesizer 500 (INTEC, Santa Fe). Effective conjugation would result in an increase in diameter between 15-20 nm compared to unfunctionalized AgNPs. To quantify the concentration of antibodies present in AgNPs-Ac-HRP dispersions, colorimetric BCA protein assay kit from Pierce Chemical Co. (Rockford, IL, USA) will be used, using a protein standard curve (BSA) and measuring absorbance at 560 nm. To study the stability and functionality of the bioconjugates. To study the stability of the bioconjugates over time, the absorbance of the bioconjugates will be measured spectrophotometrically at 0, 1, 15, 30, 60, 90 days. Considering that day 0 will correspond to the day when the AgNPs are functionalized. The working wavelength will be selected according to previous results. A decrease in intensity would indicate aggregate formation and loss of stability. Another parameter to be analyzed is the functionality of AgNPs-Ac-HRP. To evaluate it, a dot-blot assay will be performed using a protein extract obtained from a homogenate of Wistar strain rat tissue (uterus and ovary). The rat tissue samples will be obtained in collaboration with ISAL (Instituto de Salud y Ambiente del Litoral, CONICET-UNL). For this assay, nitrocellulose membranes will be used, which will be blocked with 5% PBS-milk, washed with PBS-Tween 20, and then incubated with different dilutions of: a) anti-ESR1-HRP antibodies or b) AgNPs-ESR1-HRP dispersions. After additional washes, HRP substrate (Luminol Reagent, cat no sc-2048, Santa Cruz Biotechnology, USA) will be added. Finally, the presence of the chemiluminescent signal will be analyzed using the LI -COR scanner, model C-DIGIT (Microlat SRL, Argentina). The functionality of the AgNPs-Ac-HRP will be verified by observing labeling in the seeded area of the membrane, comparing it with the positive labeling obtained for the anti-ESR1 antibody. Optimization and validation of WB. The concentration of the rat tissue protein extract will be determined with the Pierce Chemical Co. (Rockford, IL, USA) BCA protein colorimetric assay kit as previously described. A dilution of the protein extract will be seeded on acrylamide gels (4-12 %), runs will be performed in electrophoretic cuvettes and then electrotransfer onto nitrocellulose membranes. To optimize the WB, a standard protocol will be used initially and then modifications will be made according to the results obtained. For the standard WB protocol, nitrocellulose membranes will be blocked with 5% PBS-milk, washed with Tris buffer with Tween (TBST) and then incubated with AgNPs-Ac-HRP diluted in TBST-milk 2% overnight at 4 °C (shaking). The next day, the membrane will be washed with TBST and incubated with HRP substrate according to the manufacturer's specifications (Luminol Reagent, cat no sc-2048, Santa Cruz Biotechnology, USA). Molecular weights will be determined by comparison with molecular weight standards (Broad Range Protein Marker, Promega, Biodynamics, Argentina). To validate the WB, the necessary controls (positive control, negative control, etc.) and tests will be performed to evaluate parameters such as specificity, sensitivity and linear range of quantification, as detailed in the project. To compare costs between the traditional WB and the method using functionalized AgNPs: a cost estimation will be carried out taking into account: assay execution time, reagents/consumables expenses and yields, comparing both work methodologies.