Tecnología de producción de muteínas hiperglicosiladas de eritropoyetina humana

Abstract

La eritropoyetina humana (hEPO) ha sido propuesta como un candidato para el tratamiento de patologías asociadas al Sistema Nervioso Central (SNC). Con el objetivo de priorizar selectivamente las propiedades neurobiológicas de hEPO sin los efectos hematopoyéticos, se diseñaron 12 muteínas de hEPO mediante glicoingeniería por hiperglicosilación, que fueron expresadas en células CHO.K1. De las muteínas, 3 de ellas fueron previamente caracterizadas, obteniéndose resultados muy promisorios. En este estudio, las 9 variantes restantes fueron producidas, purificadas y caracterizadas mediante el análisis de sus propiedades fisicoquímicas y su función biológica in vitro. Las variantes con las mejores características (Mut 45_47 y Mut 104) fueron seleccionadas para ser expresadas en la línea celular HEK-293, con el objetivo de obtener perfiles de glicosilación más similares a la hEPO del SNC y comparar variantes expresadas en los distintos huéspedes celulares en términos de sus funciones biológicas. El análisis comparativo reveló que las variantes de HEK-293 poseen menor masa molecular y contenido de ácido siálico que sus análogos. Los ensayos biológicos in vitro confirmaron el bloqueo de la actividad eritropoyética y la preservación de la función neurobiológica. Aunque las variantes de HEK-293 presentaron propiedades farmacocinéticas menos favorables, no se observaron diferencias significativas entre líneas celulares en la actividad neurobiológica in vivo. Adicionalmente, todas las muteínas demostraron una actividad la molécula de rhEPO original. Los resultados obtenidos en la presente tesis perfilan a la línea celular HEK-293 como una plataforma de producción prometedora para análogos de hEPO con potencial terapéutico en patologías del SNC.

Human erythropoietin (hEPO) has been proposed as a candidate for Central Nervous System (CNS)-associated diseases. Aiming to selectively prioritize the neurobiological properties of hEPO while minimizing the effects associated with its erythropoietic activity, 12 hEPO muteins were previously designed in our laboratory using glycoengineering strategies through hyperglycosylation, which were expressed in CHO.K1 cells. Three of these muteins were previously characterized, yielding very promising results. In this study, the remaining 9 muteins were produced, purified, and characterized by studying their physicochemical properties and in vitro biological activity. The variants exhibiting the most favorable characteristics (Mut 45_47 and Mut 104) were selected for expression in the HEK-293 cell line. The objective was focused on obtaining muteins with a glycosylation profile similar to the hEPO physiologically produced in the CNS, and to compare variants expressed in different host cells in terms of their biological properties. Comparative analysis revealed that HEK-293-derived variants possess lower molecular mass and reduced sialic acid content compared to their counterparts. In vitro assays confirmed the ablation of erythropoietic activity and the preservation of neurobiological function. Although HEK-293 variants exhibited less favorable pharmacokinetic properties, no significant differences in in vivo neurobiological activity were observed between cell lines. Furthermore, all muteins demonstrated superior activity compared to the native rhEPO molecule. The findings of this thesis position the HEK-293 cell line as a promising production platform for hEPO analogs with therapeutic potential in CNS disorders, offering more favorable glycosylation profiles characterized by simpler, potentially less immunogenic glycans.