Desarrollo de una tecnología de producción de la enzima alfa Galactosidasa humana recombinante para uso terapéutico

Abstract

La enfermedad de Fabry es un desorden metabólico asociado al cromosoma X en forma recesiva, producido por una alteración en el catabolismo de los esfingolípidos como resultado de la actividad defectiva de la enzima alfa-Galactosidasa A. La Terapia de Reemplazo Enzimático, está disponible para el tratamiento de la enfermedad de Fabry desde el año 2001. Se han desarrollado dos presentaciones comerciales: agalsidase beta (Fabrazyme) y agalsidase alfa (Replagal). Uno de los principales inconvenientes de este tipo de terapias es su elevado costo, el número reducido de pacientes y la necesidad de administración de elevadas y repetidas dosis. En el presente trabajo se desarrolló una tecnología de producción de la enzima alfa Galactosidasa A humana recombinante (rhalfaGAL) para uso terapéutico. Inicalmente, se llevó a cabo el desarrollo de métodos analíticos que permitieran el seguimiento del proceso de producción y el aseguramiento de la calidad del producto final. Posteriormente, se generaron líneas y clones recombinantes en células CHO-K1, obteniendo clones con valores de productividad específica de hasta 8 veces mayor que los valores reportados para el clon AGA5.3 (plataforma empleada para la producción de Fabrazyme). Luego, se desarrolló el protocolo de purificación a partir de sobrenadante de cultivos, obteniendo luego del segundo paso una pureza de aproximadamente 98% y una recuperación del 60%. La caracterización fisicoquímica y bioquímica, evidenció similares características a Fabrazyme, con un perfil de glicosilación mejorado. Todos los resultados obtenidos demuestran que el bioproceso desarrollado representa una alternativa interesante para la producción de la enzima rhalfaGAL para uso terapéutico.

Fabry’s disease is an X-linked recessive metabolic disorder caused by deficiency in lysosomal alpha-Galactosidase A, producing an alteration in the catabolism of sphingolipids. Enzyme replacement therapy, in which the defective enzyme is replaced by an exogenous chronic administration of a recombinant variant, has been available for Fabry disease treatment since 2001. Currently, two commercial formulations have been developed: agalsidase beta (Fabrazyme) and agalsidase alfa (Replagal). However, this approach presented some disadvantages related to the high cost of the treatment, small number of patients and the need of repeated administration of large amount of the enzyme. In the present thesis work a production technology of the recombinant human alpha Galactosidase A (rhalphaGAL) enzyme for therapeutic use was developed. First, the optimization of reliable analytical methods was developed, in order to allow the tracing of the production process and the quality assurance of the final product. After that, recombinant cell lines and clones were developed in CHO-K1 cells, achieving up to eightfold higher productivities compared to the ones corresponding to AGA5.3 clone (the actual platform for the production of the commercially available product Fabrazyme). Later, a purification protocol was developed. The enzyme was purified from suspension culture supernatants, obtaining after the second step, 98% purity and 60% yield. Importantly, the purified enzyme evidenced biochemical and physicochemical properties similar to Fabrazyme, exhibiting improved properties regarding glycosylation. Taken together, our results represent a significant advance that could improve the overall production process of a promising therapeutic alternative for Fabry disease.