Proteínas recombinantes. Optimización de procesos de producción mediante cultivos celulares

Abstract

Se desarrollaron estrategias para la optimización del proceso de producción de proteínas recombinantes. Se utilizó como modelo de proteína recombinante la eritropoyetina humana. Químicamente es una sialoglicoproteína, por lo que una molécula sintética funcional sólo puede ser obtenida mediante el empleo de la tecnología del cultivo de células de mamífero. El trabajo incluyó la puesta a punto de diferentes técnicas analíticas, necesarias para el monitoreo de la bioquímica de los cultivos. Se emplearon distintos clones recombinantes derivados de la líneas BHK-21 y CHO-K1, productores de eritropoyetina humana. Se realizaron cultivos a escala de laboratorio y a escala piloto, en un biorreactor de tanque agitado. Se evaluó la estabilidad de clones productores, la productividad del cultivo en las distintas fases de crecimiento y el efecto de variables operativas tales como pH, oxígeno disuelto, velocidad de perfusión y concentración de suplementos como suero fetal bovino, antiespumante y citoprotectores sobre el crecimiento celular y la productividad. Los resultados obtenidos permitieron adecuar el modo de cultivo a la fase de producción. Además, la adaptación al crecimiento en suspensión sin mediación de soporte simplificó el proceso de cultivo, tanto en la elección del sistema como en su operación. Por otra parte, la caracterización del suero fetal bovino como nutriente celular, permitió racionalizar su empleo durante las fases de crecimiento y producción. Se encontró, además, que el consumo global de oxígeno se correlacionó en forma directamente proporcional con la concentración de células viables, facilitando el monitoreo on line de los cultivos.

In this work, different strategies were developed for the optimization of recombinant protein production process. Human erythropoietin, which was choice as model of recombinant protein, is a hormone secreted by renal cells. The main erythropoietin function is the intervention in the process of mature red cells production. It belong to sialoglycoproteins family, then, a functional molecule can be obtained employing the mammalian cell culture technology. The performance of different analytical techniques, useful for the cell culture biochemistry monitoring, were studied for the optimisation of production process. On the other hand, the evaluations of different cell culture conditions, employing erythropoietin producer clones from BHK-21 and CHO-K1 recombinant cell lines were tested. Static and suspension cultures were done in lab scale and in a 25 litres stirred tank bioreactor (pilot scale). The erythropoietin production maintenance was evaluated and the productivity was correlated with the culture growth phases. Moreover, the action of different operatives variables, as pH, dissolved oxygen, perfusion rate, and supplements concentration (foetal calf serum, antifoam and pluronic F-68), was studied and correlated to cell growth and productivity. The experimental results allowed fit the culture mode to the production phase. Moreover, the adaptations to the suspension growth without microcarriers simplified the culture process. On the other hand, the foetal calf serum evaluation, allowed improves their use during the growth and production culture phases. The oxygen uptake rate was close related to the viable cells concentration. It was useful for the cell growth monitoring.