Producción y evaluación de antígenos recombinantes para el diagnóstico serológico y la generación de vacunas para el control de la anaplasmosis bovina

Abstract

En este trabajo se abordó la anaplasmosis de forma integral, desde el diagnóstico y la prevención. La evaluación serológica de la enfermedad se realiza por ELISA de competición (ELISAc), utilizando como antígeno a la proteína MSP5 de A. marginale, y se utiliza para i) identificar portadores de Anaplasma spp., ii) determinar la necesidad de vacunación de los terneros en regiones endémicas y iii) evaluar la respuesta inmune a la vacunación con A. centrale. El ELISAc no está validado para la detección de anticuerpos contra A. centrale. En este trabajo se desarrollaron un ELISAc in house (ELISAhc) y un ELISA de doble paratope (ELISAdp), basados en las proteínas truncadas (sin la hélice de transmembrana) MSP5 de A. marginale (tMSP5m) y MSP5 de A. centrale (tMSP5c), logrando mayor especificidad y sensibilidad y evitando el uso de anticuerpos monoclonales (ELISAdp). Para la prevención de la anaplasmosis se evaluó un inmunógeno recombinante, para uso en animales adultos, compuesto por cinco proteínas subdominantes de A. marginale pertenecientes al sistema de secreción tipo IV (T4SS): VirB9.1, VirB9.2, VirB10, VirB11 y Ef-Tu. Las proteínas fueron expresadas en E. coli y evaluadas en novillos con los adyuvantes Quil A® y MontanideTM. Se aplicaron cuatro dosis de vacuna a intervalos de tres semanas y luego los novillos se desafiaron con una dosis de 107 eritrocitos parasitados con A. marginale. Post desafío, se observaron signos clínicos de anaplasmosis en todos los animales. La vacuna en las condiciones ensayadas no resultó eficaz, sin embargo, sienta las bases para futuros experimentos.

In this work, bovine anaplasmosis was studied integrally with diagnosis and prevention approaches. Serological evaluation performed by a competition ELISA (cELISA), using the protein MSP5 of A. marginale as antigen, allows us: i) identify carriers of Anaplasma spp., ii) determine the need of vaccination of calves in endemic regions, and iii) evaluate the immune response to the A. centrale vaccine. The cELISA is not validated for the detection of antibodies against A. centrale. In this work, a cELISA in house (hcELISA) and a double paratope ELISA (dpELISA) were optimized both based on the truncated forms (without transmembrane helix) of A. marginale MSP5 (tMSP5m) and A. centrale MSP5 (tMSP5c). These tests increased the specificity and sensitivity and avoided the use of monoclonal antibodies (dpELISA). For the prevention of anaplasmosis, a recombinant immunogen was developed for its evaluation in adult cattle. This immunogen was formulated with the subdominant proteins of type IV secretion system (T4SS) of A. marginale, VirB9.1, VirB9.2, VirB10, VirB11, and Ef-Tu. The proteins were expressed in E. coli and evaluated in steers with the adjuvants Quil A® and MontanideTM. Cattle received four vaccine doses at three-week intervals and then were challenged with 107 A. marginale-parasitized erythrocytes. After challenge, all cattle showed clinical signs of anaplasmosis. The vaccine, which under the tested conditions was not effective, establishes guidelines for future assays.