Caracterización estructural y funcional de enzimas del metabolismo redox y de la partición del carbono en Euglena gracilis. Estudio de la importancia en la regulación de la síntesis y degradación de paramilón

Abstract

Euglena gracilis es un protista unicelular fotosintético que ha llamado la atención por su resistencia al estrés causado por metales pesados y por sintetizar metabolitos de interés comercial, entre ellos el paramilón. Este es su polímero de reserva, un beta-1,3-glucano insoluble en agua. La información enzimológica referente al metabolismo redox y del paramilón en E. gracilis aún es limitada. Por esta razón, seleccionamos las enzimas glutamato cisteína ligasa (EgrGCL, EC 6.3.2.2), glicosil fosforilasa de la familia 149 (EgrGH149, EC 2.4.1) y glicosil hidrolasa de la familia 64 (EgrGH64, EC 3.2.1.39) para realizar la producción recombinante y estudiarlas desde distintos enfoques. EgrGCL presenta actividad empleando como sustratos ATP, cisteína y glutámico con parámetros cinéticos similares a lo observado en otras GCL caracterizadas. EgrGH149 es específica para la utilización de beta-1,3-glucanos de baja masa molecular como sustrato, sin evidenciar actividad con beta-1,3-glucanos de alta masa molecular. Identificamos residuos relevantes en la catálisis por primera vez en una enzima de esta familia. EgrGH149 se encontraría contigua a los gránulos de paramilón formando agrupaciones. Esta es la primera vez que una beta-1,3-endoglucanasa de E. gracilis es producida recombinantemente usando un sistema de expresión procariota. EgrGH64 evidenció actividad enzimática empleando los sustratos laminarina, paramilón y beta-glucano de pared celular de levadura. El principal producto de hidrólisis de EgrGH64 fue laminaripentaosa. Evidenciamos la presencia de esta enzima en determinadas condiciones de cultivo y su efecto antifúngico. Los conocimientos generados en este trabajo de Tesis nos aportan una mejor comprensión del contexto metabólico de E. gracilis

Euglena gracilis is a photosynthetic unicellular protist. It has attracted attention for its resistance to heavy metal stress and the synthesis of commercially interesting metabolites. Paramylon is its storage polymer, a water-insoluble beta-1,3-glucan. There is a lack of information regarding redox and paramylon metabolism. The enzymes glutamate cysteine ligase (EgrGCL, EC 6.3.2.2), glycosyl phosphorylase family 149 (EgrGH149, EC 2.4.1) and glycosyl hydrolase family 64 (EgrGH64, EC 3.2.1.39) where select to perform recombinant production and study them from different approaches. We observed activity in EgrGCL using ATP, cysteine and glutamic acid as substrates. The kinetic parameters were like those observed in other characterized GCLs. EgrGH149 is specific for the use of low molecular weight beta-1,3-glucans as substrates, without activity with high molecular weight beta-1,3-glucans. For the first time in an enzyme of this family, we identified residues relevant in catalysis. EgrGH149 would be found forming clusters adjacent to the paramylon granules. This is the first time that a beta-1,3-endoglucanase from E. gracilis has been produced in a recombinant form using a prokaryotic expression system. EgrGH64 showed enzymatic activity using laminarin, paramylon and yeast cell wall β-glucan as substrates. The main hydrolysis product of EgrGH64 was laminaripentaose. We observed the antifungal effect of this enzyme under certain culture conditions. The knowledge generated in this work provides a better understanding of E. gracilis metabolic context.