Reproductive biology of Rhodophiala bifida (Amaryllidaceae): application aspects in breeding.

Rhodophiala bifida is a bulbous species native to Argentina, Brazil, Paraguay and Uruguay. The size and color of its flowers make it very attractive for ornamental cultivation. The development of domestication and breeding protocols are essential to propose it as a new crop, considering that the global floricultural industry requires novelties. As a starting point, compatibility and reproductive efficiency studies were carried out through controlled crosses considering phenotypes of fl owers of different color. Both self-pollination and cross-pollination produced fruits, so a mixed reproductive system was verifi ed in R. bifida. Reproductive efficiency was significantly higher in cross-pollination than in self-pollination, being 49.6 and 19 respectively, for red flowers, the most representative genotype of the population. No fruiting was observed in emasculated flowers without pollination, so autonomous apomixis was ruled out. The crossings among phenotypes produced fruits except for the case of crossings between pink by fuchsias fl owered phenotypes.

Key words: selfcompatibility, reproductive effi ciency, plants native to Argentina, ornamentals, breeding.

INTRODUCCION El tamaño y color de sus flores la hacen muy atractiva para el cultivo ornamental. Rhodophiala bifida (Herb.) Traub – azu-Además, se propone especialmente para cenita colorada- es una especie bulbosa xerojardinería, ya que tiene bajo requeriperteneciente a la familia Amaryllidaceae, miento hídrico y nutricional que la hace nativa de Argentina, Brasil, Paraguay y Uru-apta para jardines con un uso racional del guay (Arroyo-Leuenberger, 1996). Esta fa-agua, aspecto muy valorado en tiempos en milia se destaca por sus numerosos géneros que se busca mitigar los efectos del camcultivados como plantas ornamentales tales bio climático (Bisgrove y Hadley, 2002). El como Amaryllis, Crinum, Galanthus, Leuco-desarrollo de protocolos de domesticación, jum, Lycoris y Narcissus (Simpson, 2006). propagación y mejoramiento genético son

En Argentina, R. bifida se distribuye en esenciales para poder proponerla como un las provincias de Buenos Aires, Entre Ríos, nuevo cultivo, considerando que la indus-Corrientes y Misiones en pastizales de sue-tria florícola global requiere novedades. los fértiles y bien drenados (Hurrell et al., En Amaryllidaceae se encuentran es2009). Es una especie perenne de floración pecies con distintos grados de compatibiestival tardía que se concentra luego de las lidad (Broyles y Wyatt, 1991; Fernandez lluvias. Las inflorescencias están formadas et al., 2013; Saavedra et al., 1996; Sage por 2 a 7 flores zigomorfas, infundibulifor-et al., 1999) e incompatibilidad (Streher mes, declinadas y pediceladas. Sus flores et al., 2018). En algunos casos, se evidenpresentan 6 tépalos de color rojo carmín, ció autoincompatibilidad de acción tardía bermellón, rojo vinoso, rosado y rara vez (Kiepiel y Johnson, 2014; Vaughton et al., blanco (Hurrell et al., 2009). 2010). A pesar de ello, la mayoría de los sistemas reproductivos de las plantas de la familia siguen siendo desconocidos, especialmente en las especies del hemisferio sur, donde se encuentran la mayor diversidad (Kiepiel y Johnson, 2014).

MATERIALES Y MÉTODOS

G. Facciuto et al.

Figura 1: Población de Rhodophiala bifida del Jardín Botánico Arturo Ragonese, Instituto de Recursos Biológicos INTA (arriba). Fenotipos de flores rojas, fucsias, rosas (de izquierda a derecha, abajo). Figure 1: Population of Rhodophiala bifida of the Botanical Garden Arturo Ragonese, Instituto de Recursos Biológicos INTA (above). Phenotypes of red, fuchsia, pink flowers (from left to right, below).

millas obtenidas por fruto y su germinación, para lo cual las semillas se colocaron en cajas plásticas sobre papel de filtro (3) y se mantuvieron en cámara a 25 ± 2º C y con un fotoperíodo de 16 horas luz/8 horas oscuridad. A los 14 días de la siembra, se procedió al conteo de las plántulas normales obtenidas.

La eficiencia reproductiva se calculó según la fórmula de Dafni (1992): (Nº frutos/ Nº flores polinizadas) x (Nº promedio de semillas por fruto/Nº promedio óvulos/ ovario) y se le agregó el factor Nº plántulas normales/Nº semillas sembradas. El número promedio de óvulos por ovario se calculó contando todos los óvulos de 15 ovarios sobre lupa.

El índice de autocompatibilidad (IAI) se obtuvo como el cociente entre el porcentaje de frutos producidos por autopolinización y el porcentaje obtenido por polinización cruzada según Ruiz y Arroyo (1978).

Los datos se sometieron a análisis estadísticos a través de tests de diferencia de proporciones y ANOVA (p ≤0.05) con el programa INFOSTAT 2009 (Di Rienzo et al., 2011).

Crecimiento del tubo polínico

Para evaluar la velocidad y reacción de los tubos polínicos en los cruzamientos, se recolectaron pistilos al primero, segundo y tercer día posterior a las polinizaciones (DPP), tanto en la autopolinización como en polinización cruzada. Se fijaron en FAA (formol; ácido acético; etanol/1: 0,5:8) por, al menos, 24 horas. Luego, se enjuagaron con agua destilada y se trataron con NaOH 8 N a 60º C por dos horas según el método de Martin (1959). Los pistilos se enjuagaron nuevamente, se tiñeron con azul de anilina al 1% en agua durante una hora y se montaron sobre un portaobjetos con una gota de la mencionada solución, se cubrieron con un cubreobjetos y se presionó levemente. Se observaron con microscopio de epi-fluorescencia OLYMPUS BX 50 (Japón) con filtros de excitación y emisión de 330-385 nm y 420 nm, respectivamente. Se evaluó el crecimiento del tubo polínico en los pistilos considerando la distancia recorrida y a los 3 DPP se contabilizó la cantidad de tubos polínicos que llegaron al ovario. Se evaluaron 10 pistilos por tratamiento.

RESULTADOS

Los cruzamientos derivados de la autopolinización y la polinización cruzada produjeron frutos en R. bifida. En la Tabla 1 se presentan los datos de fructificación, producción de semillas por fruto y plántulas obtenidas en la auto-polinización y en la polinización cruzada en los cruzamientos realizados utilizando flores rojas, genotipo predominante en la población estudiada (experimento 1). La capacidad de producir frutos fue significativamente mayor en la polinización cruzada respecto a la autopolinización siendo de 79.6% y 52.6 %, respectivamente. Dicha tendencia también se reflejó en los valores de eficiencia reproductiva siendo 19 y 49.6 para la autopolinización y polinización cruzada, respectivamente. En ningún caso las flores emasculadas y no polinizadas produjeron frutos.

En el segundo experimento se produjeron frutos tanto en la autopolinización como en la polinización cruzada considerando los tres fenotipos florales (Tabla 2). El porcentaje de fructificación fue mayor en la polinización entre los fenotipos de flores fucsias y entre los de flores rosas; las plantas de flores rojas no presentaron diferencias significativas. A pesar de esta excepción, los valores de semillas por fruto fueron significativamente mayores en la polinización cruzada en los tres fenotipos (Tabla 2). Los datos de IAI para los fenotipos de flores rojas, fucsias y rosas, fueron 0.89, 0.09 y 0.30 respectivamente (Tabla 2).

No hubo diferencias significativas en la fructificación natural entre los tres fenotipos para color de flor; el porcentaje de formación de frutos en flores marcadas sin polinizar manualmente arrojó valores de 78,37%, 85% y 71,11% para fenotipos de flores rojas, rosas y fucsias, respectivamente (Tabla 2).

El estudio del crecimiento de los tubos polínicos en los pistilos autopolinizados y sometidos a polinización cruzada para el caso de flores rojas demostró que, a los 3 DPP, éstos llegan a los ovarios en ambos casos. En la Fig. 2 se graficaron la cantidad de muestras observadas (%) y la cantidad de tubos polínicos observados. Debido al elevado número de tubos polínicos y a su superposición resultó metodológicamente imposible realizar un recuento de los mismos cuando superaban los 100 tubos. A pesar de ello, se observó una diferencia muy notoria ya que se contabilizaron hasta 20 y más de 100 tubos polínicos en el ovario de pistilos autopolinizados y sometidos a polinización

DISCUSIÓN

A partir de los resultados de los cruzamientos dirigidos, germinación de las semillas y los estudios del crecimiento del tubo polínico se comprobó un sistema reproductivo mixto para R. bifida. A pesar de ello, la eficiencia reproductiva y la producción de semillas fueron menores en la autopolinización, tal como Ladd y Arroyo (2009) reportaron para R. rhodolirion. La autopolinización generó una menor producción de semillas que la polinización cruzada, esta característica también se ha presentado en otras especies de Amaryllidaceae tales como Narcissus triandrus (Sage et al., 1999) y Hippeastrum advenum (Saavedra et al., 1996) y Habranthus tubispathus (Fernandez et al., 2013). Para el caso de Zephyranthes atamasco, Broyles y Wyatt (1991) hallaron la misma cantidad de semillas en frutos provenientes de autopolinización que en la polinización cruzada. La longevidad de cada flor de R. bifida fue de aproximadamente 3 días (observación de las autoras), período que, por ser tan corto, requeriría de una polinización y fecundación eficientes como lo sugiere este caso al producir frutos y semillas viables, tanto en la autopolinización, como en la polinización cruzada.

Según Echeverría y Alonso (2010), las semillas de R. bifida presentarían nula a escasa dormición innata ya que germinan casi en su totalidad luego de dos meses de la cosecha. A partir de los resultados obtenidos por estos autores, se infiere que la dormición no estaría interfiriendo en la cantidad de plántulas normales obtenidas a partir de las semillas sembradas en los cruzamientos realizados en este trabajo.

Los estudios del crecimiento del tubo polínico en ambas situaciones (autopolinización y polinización cruzada) fueron consistentes con la cantidad de semillas obtenidas ya que, en la polinización cruzada la cantidad de tubos polínicos que arribaron al ovario fue significativamente mayor. Esta característica demostró que a pesar de que R. bifida produce semillas viables a partir, tanto de la autopolinización como de la polinización cruzada, resulta más eficiente cuando se producen por esta última. Se puede sugerir la presencia de una reacción de autoincompatibilidad débil, que se acentúa en el caso de los fenotipos de flores fucsias.

La autoincompatibilidad es un sistema de auto-reconocimiento genético que favorece el cruzamiento entre individuos diferentes en plantas con flores hermafroditas (Durand et al., 2020). Es una de muchas estrategias que se cree ha evolucionado en respuesta al efecto negativo de la depresión por endocría, causada por la expresión de alelos deletéreos en homocigotas (Charlesworth y Charlesworth, 1987). El mantenimiento de la autoincompatibilidad en una población, como podría haber sucedido en esta especie, es reflejo del balance entre las ventajas aportadas por la prevención de los efectos deletéreos de la endocría y sus desventajas, que radican en la limitación reproductiva que este mecanismo conlleva (Durand et al., 2020).

Los resultados de IAI obtenidos en este trabajo, 0.89 y 0.30 para plantas de flores rojas y rosas respectivamente la clasifican como autocompatible. Según Ruiz y Arroyo (1978) un IAI mayor o menor a 0.20 indica una especie autocompatible o autoincompatible, respectivamente.

Stevens (2001) afirma que, de acuerdo con la bibliografía tradicional, la presencia de especies con IAI intermedio es común. Radusky et al. (2010) analizaron el IAI de 1238 especies correspondientes a 144 familias y determinaron que la frecuencia de la

CONCLUSIONES

AGRADECIMIENTOS

REFERENCIAS

Broyles S B, Wyatt R. 1991. The breeding system of Zephyranthes atamasco (Amaryllidaceae). Bull. of the Torrey Bot. Club 118(2): 137-140.

Charlesworth D, Charlesworth B. 1987. Inbreeding depression and its evolutionary consequences. Annual review of Ecology and Systematics 18: 237-268.

Dafni A. 1992. Pollination ecology, a practical approach. Oxford University Press, Oxford. 245 pp.

Di Rienzo JA, Casanoves F, Balzarini M G, Gonzalez L, Tablada M, Robledo CW. 2011. InfoStat, FCA, Universidad Nacional de Córdoba, Argentina. URL http://www. infostat. com. Ar

Durand E, Chantreau M, LeVeve A, Stetsenko R, Dubin M, Genete M, Llaurens V, Poux C, Roux C; Billiard S, Vekemans X, Castric V. 2020. Evolution of self-incompatibility in the Brassicaceae: Lessons from a textbook example of natural selection. Evolutionary applications 00: 1-19.

Echeverría M L, Alonso S I. 2010. Germinación y crecimiento inicial de Amarilidáceas nativas con potencial ornamental. Rev. Fac. Ciencias Agr. Univ. Nac. Cuyo 42 (1): 23-37.

Fernandez A C, Marinangeli P, Curvetto N, Facciuto G. 2013. Reproductive biology of Handroanthus tubispathus. Acta Hort. 1000: 183

188.

Gómez L. 1993. Carta básica semidetallada de suelos. Complejo de Investigaciones Castelar, INTA, Provincia de Buenos Aires. INTA-CIRN, Instituto de Suelos, Buenos Aires, 114 p.

Hurrell J A, Roitman G, Delucchi G. 2009. Amarillydaceae. En Flora Rioplatense. Sistemática, ecología y etnobotánica de las plantas vasculares rioplatenses. Parte 3 vol 4. Director J.A. Hurrell.

Kiepiel I A N, Johnson S D. 2014. Breeding systems in Clivia (Amaryllidaceae): late-acting self -incompatibility and its functional consequences. Bot. J. of the Linnean 175:155–168.

Ladd P G, Arroyo M T K. 2009. Comparisons of breeding systems between two sympatric species, Nastanthus spathulatus (Calyceraceae) and Rhodophiala rhodolirion (Amaryllidaceae), in the high Andes of central Chile. Plant Species Biol. 24: 2–10.

Martin F. 1958. Staining and observing pollen tubes in the styles by means of fluorescence. Stain Tech. 34:125–128.

Raduski A R, Haney E B, Igic B. 2011. The expression of self-incompatibility in angiosperms is bimodal. Evol. 66-4: 1275–1283.

Ruiz T Z, Arroyo M T K. 1978. Plant reproductive ecology of secondary deciduous forest in Venezuela. Biotropica 19: 221-230.

Saavedra F, Arroyo M T K, Hoffmann A J. 1996. The breeding system of Hyppeastrum advenum (Ker-Gawl.) Herb. (Amaryllidaceae), an endemic bulbous geophyte of the mediterranean-type climate region in central Chile. Botanische Jahrbücher fur Systematik, Pflanzengeschichte und Pflanzengeographie 118 (1):1-8.

Sage T L, Strumas F, Cole W W, Barrett S C H. 1999. Differential ovule development following self- and cross-pollination: the basis of self-sterility in Narcissus triandrus (Amaryllidaceae). A. J. of Bot. 86:855-870.

Simpson M G 2006. Plant Systematics. Amaryllidaceae. Elsevier Academic Press. Canada. pp. 169-171.

Stevens PF. 2001. Angiosperm phylogeny website. Version 14, accedido 28 Julio 2017. http:// www.mobot.org/MOBOT/research/APweb/.

Streher N S, Guerra E, Lüdtke R, Semir J, Dutilh J H A. 2018. Self-incompatibility in Habranthus gracilifolius (Amaryllidaceae): pre- and post-pollination barriers. Braz. J. of Bot. 41(2) 375-384.

Vaughton G, Ramsey M, Johnson S D. 2010. Pollination and late acting self-incompatibility in Cyrtanthus breviflorus (Amaryllidaceae): implications for seed production. Annals of Bot. 106 (4): 547-555.