NIVEL DE ADN-PLOIDÍA EN POBLACIONES SUDAMERICANAS Y NORTEAMERICANAS DE LA GRAMÍNEA NATIVA DISYUNTA Trichloris crinita (CHLORIDOIDEAE, POACEAE)
CARLONI, E. J.1*; QUIROGA, R. E.2,3*;
GRUNBERG, K. A.1,4 & PREMOLI, A. C.5
RESUMEN
Trichloris crinita es una gramínea nativa de distribución disyunta que habita regiones áridas y semiáridas de Sud y Norteamérica. Trabajos previos mostraron uniformidad en el nivel de ploidía en poblaciones sudamericanas de la especie (2n = 4x = 40); sin embargo, se desconocen valores de referencia para poblaciones norteamericanas. En el presente trabajo se implementó un protocolo para cuantificar el contenido de ADN nuclear (indicador de ADN-ploidía) mediante citometría de flujo, y comparar dicho valor en 22 poblaciones provenientes de Sudamérica (15) y Norteamérica (7). No se encontraron diferencias de contenido de ADN nuclear entre poblaciones sudamericanas y norteamericanas (valor 2C promedio = 1,97 pg) y tampoco entre poblaciones dentro de cada uno de dichos subcontinentes, sugiriendo que todas presentan el mismo nivel de ploidía. Estos resultados proporcionan datos de referencia sobre el contenido de ADN nuclear de T. crinita a lo largo de su rango en Sud y Norteamérica.
Palabras clave: citometría de flujo, disyunción anfi tropical, nivel de ploidía, Norteamérica, gramínea forrajera nativa, Sudamérica.
1.- Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA), Instituto de Fisiología y Recursos Genéticos Vegetales, Centro de Investigaciones Agropecuarias, Av. 11 de Septiembre 4755. X5014MGO - Córdoba, Argentina. 2.- Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria, Estación Experimental Agropecuaria Catamarca, Ruta Provincial 33 Km 4. CP4700 - Catamarca, Argentina. 3.- Cátedra de Manejo de Pastizales Naturales, Facultad de Ciencias Agrarias, Universidad Nacional de Catamarca. Maestro Quiroga 50. CP4700 – Catamarca, Argentina. 4.- Consejo de Nacional Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET), Godoy Cruz 2290. C1425FQB - CABA, Argentina. 5.- INIBIOMA, CONICET - Universidad Nacional del Comahue, Quintral 1250, Bariloche - 8400, Argentina *Contribuyeron igualmente al presente artículo (e-mails de contacto: edgardocarloni@gmail.com , quiroga.raul@inta.gob.ar). Manuscrito recibido el 26 de marzo de 2020 y aceptado para su publicación el 29 de mayo de 2020.
Carloni, E.J.; Quiroga, R.E.; Grunberg, K.A.; Premoli, A.C. Nivel de ADN-ploidía en poblaciones sudamericanas y norteamericanas de la gramínea nativa disyunta Trichloris crinita (Chloridoideae, Poaceae). FAVE - Ciencias Agrarias 20 (1): 219-227. CC BY-NC-SA 4.0
E. J. Carloni et al.
ABSTRACT
DNA-ploidy level in South American and North American populations of the native disjunct grass Trichloris crinita.
Trichloris crinita is a native grass with a naturally disjunct distribution inhabiting arid and se-mi-arid regions of South and North America. Previous studies documented a uniform ploidy level in South American populations of the species (2n = 4x = 40); however, no reference values are known for North American populations. In the present work, a protocol was implemented in the species to quantify the nuclear DNA content (DNA-ploidy indicator) by flow cytometry, and this value was compared in 22 populations from South America (15) and North America (7). No differences in nuclear DNA content were found between South American and North American populations (average 2C value = 1,97 pg) neither among populations within each continent, suggesting that they all present the same ploidy level. These results provide reference values for the nuclear DNA content of T. crinita in South and North America.
Key words: amphitropical disjunct, flow cytometry, native forage grass, North America, ploidy level, South America.
INTRODUCCIÓN Zabala et al., 2011) y productivos (Gil Báez
et al., 2015; Greco y Cavagnaro, 2005).
Trichloris crinita (Lag.) Parodi (Chlori-Uno de los aspectos básicos en la ecodoideae, Poaceae) es una gramínea nativa logía de poblaciones de plantas nativas es perenne, distribuida naturalmente de forma conocer si existe variabilidad intraespecífidisyunta en regiones áridas y semiáridas ca en el nivel de ploidía (Lučanová, 2019). de Sud y Norteamérica (Peterson et al., Recientemente, diferentes estudios citoge2007). En ambos subcontinentes, la especie néticos combinando análisis de citogenética es promovida en planes de restauración de clásica y molecular realizados en 20 poblaambientes degradados (Kozub et al., 2018; ciones argentinas de T. crinita han demostra-USDA-NRCS, 2007). En zonas áridas y do que las mismas presentan igual nivel de semiáridas de Argentina, debido a su tole-ploidía 2n = 4x = 40 (Kozub et al., 2019). rancia a la sequía y su aptitud forrajera, es No obstante, variaciones intraespecíficas en una especie recomendada para la restaura-el nivel de ploidía han sido reportadas en la ción de campos ganaderos impactados por subfamilia Chloridoideae (De Silva y Snaysobrepastoreo (Blanco et al., 2013; Quiroga don, 1995; Nakagawa et al., 1987). En geet al., 2009). Estudios previos han evalua-neral, estas variaciones son de suma impordo la biología reproductiva en poblaciones tancia en estudios de restauración ya que poargentinas de la especie (Gutiérrez et al., drían traer aparejada la adaptación a diferen2016; Kozub et al., 2017), diversidad gené-tes condiciones ambientales (Husband et al., tica (Cavagnaro et al., 2006) y de caracte-2013; Lučanová, 2019). En este sentido, un res adaptativos (Greco y Cavagnaro, 2003; trabajo previo ha demostrado que las pobla-Marinoni et al., 2018; Quiroga et al., 2010; ciones de T. crinita de Sudamérica tienden a distribuirse en ambientes menos áridos y calientes que las poblaciones de Norteamérica (en promedio, +200 mm de precipitación anual y -1,5°C de temperatura media anual, Quiroga et al., 2018). Teniendo en cuenta lo mencionado y al no encontrar registros en los niveles de ploidía para las poblaciones de Norteamérica, surge la inquietud de conocer si poblaciones de áreas geográficas disyuntas que abarcan climas diferentes presentan, a su vez, niveles de ploidía diferentes.
Una alternativa disponible para realizar estudios taxonómicos es la citometría de flujo (CMF) (Lysák y Doležel, 1998; Marie y Brown, 1993). La técnica permite cuantificar el contenido de ADN nuclear de una planta (valor 2C) y a partir de ello inferir el nivel de ploidía (Dolezěl et al., 2007; Greilhuber et al., 2005). Una de las principales ventajas de la CMF, con respecto al método clásico, es que no necesita células en división del material vegetal (Doležel et al., 2007). Además, los protocolos utilizados son sencillos y rápidos, lo que permite el análisis de numerosas muestras por día (Loureiro et al., 2006; Otto, 1990). La interpretación de los resultados, en términos de ploidía, se realiza a partir del estudio del contenido de ADN nuclear (valor 2C) obtenido del análisis conjunto de la muestra incógnita con un estándar de referencia (Galbraith et al., 2002). Cuando el nivel de ploidía es inferido sólo mediante CMF, los resultados deben distinguirse de los estudios cariológicos, por lo cual se utiliza el termino ploidía del ADN (ADN-ploidía; Suda et al., 2006).
Los objetivos del presente trabajo fueron: i) desarrollar un protocolo para cuantificar el contenido de ADN nuclear y ii) comparar el nivel de ploidía del ADN en diferentes poblaciones de T. crinita provenientes de Sudamérica y Norteamérica.
MATERIALES Y MÉTODOS
Material vegetal
Se evaluaron poblaciones existentes en la colección de T. crinita de INTA EEA Catamarca. Esta colección cuenta con materiales provenientes de 22 poblaciones naturales de la especie, 15 de Sudamérica y 7 de Norteamérica (Tabla 1).
Análisis por citometría de flujo
Los análisis por CMF se realizaron a partir de hojas frescas. Las muestras se procesaron utilizando el protocolo de Doležel et al. (2007) con pequeñas modificaciones. Segmentos de hojas de 4 - 6 cm2 de T. crinita y del estándar de referencia [Glycine max
cv. Polanka (2n = 40, 2C = 2,5 pg ADN)] (Doležel et al., 1994) fueron picados en forma conjunta en 1 ml de solución tampón Otto I (0,1 M ácido cítrico monohidratado, 0,5% Tween 20) (Otto, 1990). Luego de filtrar las muestras por una malla de 30 μm, se centrifugaron a 1500 rpm por 5 minutos y el sobrenadante fue eliminado teniendo la precaución de dejar 100 μl en cada tubo de 1,5 ml. Las muestras se resuspendieron en 100 μl de solución tampón Otto I con agitación suave y se incubaron en cámara fría (4°C) durante 24h. Posteriormente, se agregó 1 ml de solución tampón Otto II (0,4 M Na2HPO4 .12H2O), 50 μg/ml de ioduro de propidio (IP) (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO), 50 μg/ml de ARNasa (Sigma-Aldrich, St. Louis, MO). El IP y la ARNasa se utilizaron para marcar el ADN nuclear y evitar fluorescencia del ARN de doble cadena, respectivamente. Las muestras se incubaron durante 10 minutos a temperatura ambiente, para luego ser corridas en un BD Accuri™ C6 (BD Biosciences, San Jose, California, USA). Los histogramas de
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E. J. Carloni et al.
intensidad de fluorescencia relativa (FR) fueron evaluados con el programa BD Accuri™ C6. Los núcleos obtenidos en los histogramas de FR en la fase lineal fueron encerrados en una región y ambos picos G0/ G1 del estándar y de la muestra, fueron evaluados. Se analizaron de 2 a 3 individuos de cada población. El contenido de ADN nuclear relativo de las plantas se expresó mediante un índice de fluorescencia (IF) teniendo en cuenta al estándar de referencia (IF = 2C T. crinita/2C G. max). El tamaño del genoma de cada individuo, expresado en picogramos (pg), fue estimado multiplicando los valores de IF por 2,5 (contenido de ADN nuclear de G. max).
Análisis estadístico
Los datos de contenido de ADN nuclear (2C) se analizaron mediante análisis de varianza (α=0,05), considerando al subcontinente de origen como factor de efecto fijo y a las poblaciones anidadas dentro de cada subcontinente como factor de efecto aleatorio. Se usó el software estadístico InfoStat (Di Rienzo et al., 2012).
RESULTADOS
El histograma de intensidad de fluorescencia relativa (FR) de T. crinita analizado en conjunto con G. max como estándar de referencia mostró cuatro picos, dos representando el contenido relativo de ADN nuclear de T. crinita y los otros dos de G. max (Figura 1). Los picos dominantes co-
Figura 1. Histograma de intensidad de fluorescencia obtenido tras el análisis simultaneo de núcleos aislados de hojas de T. crinita y G. max. Los picos 1 y 2 corresponden a los núcleos en la fase G0/G1 de T. crinita (1) y G. max (2), mientras que los picos 3 y 4 corresponden a los núcleos en la fase G2 de T. crinita (3) y de G. max (4). Figure 1. Fluorescence intensity histogram obtained after the simultaneous analysis of isolated nuclei from leaves of T. crinita and G. max. Peaks 1 and 2 correspond to the nuclei in the G0 /
phase of T. crinita (1) and G. max (2), while peaks 3 and 4 correspond to the nuclei in the G2
G1
phase of T. crinita (3) and G. max (4).
rresponden a los núcleos en la fase G0/G1 cencia (IF, 0,76 - 0,81) y contenido de ADN (contenido de ADN nuclear, 2C), mientras nuclear (2C, 1,90 - 2,01 pg; Tabla 1). En que los picos menores corresponden a los ese sentido, no se encontraron diferencias núcleos en la fase G2 del ciclo celular (con-significativas de contenido de ADN nuclear tenido de ADN nuclear, 4C). La ausencia entre poblaciones de Sudamérica y Nor-de solapamiento de los picos generados in-teamérica (P= 0,955, promedio en ambos dica que el estándar interno fue adecuado. subcontinentes = 1,97 pg), y tampoco entre
En general, se observó escasa variación poblaciones dentro de cada subcontinente entre poblaciones en el índice de fluores-(P= 0,097; Tabla 1).
Tabla 1. Denominación de las 22 poblaciones de T. crinita, provincia/estado, país y coordenadas de origen. Se muestra para cada una la cantidad de individuos (n) analizados por citometría de flujo, el índice de fluorescencia (IF) ± desvío estándar, y contenido de ADN nuclear promedio (valor 2C, en pg) ± desvío estándar. Table 1. Denomination of the 22 populations of T. crinita, province / state, country and coordinates of origin. For each population we present the number of individuals (n) analyzed by flow cytometry, the average fluorescence index (ID) ± standard deviation, and the average nuclear DNA content (2C value, in pg) ± standard deviation.
| Población | Provincia/ estado | País | Lat. | Long. | n | IF | ±D.E. | 2C | ±D.E. |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| Colpes | Catamarca | ARG | -28,06 | -66,22 | 2 | 0,81 | 0,001 | 2,01 | 0,002 |
| El Tipán | Catamarca | ARG | -28,99 | -65,76 | 2 | 0,78 | 0,001 | 1,96 | 0,002 |
| Recreo | Catamarca | ARG | -29,31 | -65,14 | 2 | 0,80 | 0,017 | 1,99 | 0,042 |
| Recreo Salinas | Catamarca | ARG | -29,52 | -64,97 | 2 | 0,79 | 0,003 | 1,98 | 0,008 |
| San Martín | Catamarca | ARG | -29,21 | -65,77 | 2 | 0,77 | 0,001 | 1,93 | 0,001 |
| HC | Córdoba | ARG | -29,96 | -63,48 | 2 | 0,78 | 0,001 | 1,95 | 0,002 |
| HL | Córdoba | ARG | -29,89 | -64,46 | 2 | 0,80 | 0,003 | 1,99 | 0,007 |
| Chamical * | La Rioja | ARG | -30,51 | -66,14 | 2 | 0,80 | 0,010 | 2,01 | 0,025 |
| Salinas Grandes | La Rioja | ARG | -30,60 | -65,60 | 3 | 0,78 | 0,016 | 1,95 | 0,041 |
| SC | La Rioja | ARG | -31,40 | -66,77 | 2 | 0,79 | 0,006 | 1,97 | 0,015 |
| SL | La Rioja | ARG | -31,52 | -66,81 | 2 | 0,79 | 0,018 | 1,97 | 0,044 |
| Tilimuqui | La Rioja | ARG | -29,14 | -67,43 | 2 | 0,77 | 0,005 | 1,94 | 0,013 |
| RCH Ancha | Mendoza | ARG | -34,26 | -67,90 | 2 | 0,78 | 0,009 | 1,96 | 0,023 |
| RCH Fina | Mendoza | ARG | -34,26 | -67,90 | 3 | 0,78 | 0,014 | 1,94 | 0,036 |
| Amblayo | Salta | ARG | -25,46 | -65,83 | 2 | 0,80 | 0,021 | 2,00 | 0,053 |
| Bowie | Arizona | EEUU | 32,28 | -109,29 | 2 | 0,78 | 0,006 | 1,96 | 0,015 |
| San Simon | Arizona | EEUU | 32,28 | -109,27 | 2 | 0,79 | 0,004 | 1,98 | 0,009 |
| Knox | New Mexico | EEUU | 32,28 | -106,76 | 2 | 0,80 | 0,013 | 1,99 | 0,033 |
| Lucero | New Mexico | EEUU | 33,10 | -106,53 | 3 | 0,79 | 0,003 | 1,99 | 0,008 |
| White Sands | New Mexico | EEUU | 32,47 | -106,41 | 2 | 0,76 | 0,031 | 1,90 | 0,078 |
| Kinney * | Texas | EEUU | 29,32 | -100,43 | 2 | 0,79 | 0,005 | 1,97 | 0,013 |
| Tornillo | Texas | EEUU | 31,40 | -106,01 | 2 | 0,79 | 0,019 | 1,98 | 0,047 |
* Las poblaciones ‘Chamical’ y ‘Kinney’ son materiales vegetales registrados por el Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria de Argentina (INTA, https://inta.gob.ar/variedades/chamical-inta) y el Departamento de Agricultura de Estados Unidos (USDA-NRCS, 2007), respectivamente.
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E. J. Carloni et al.
DISCUSIÓN
Los resultados obtenidos en el presente trabajo indican que todas las poblaciones evaluadas de T. crinita, tanto de Sudamérica como de Norteamérica, presentan similar contenido de ADN nuclear (2C entre 1,95 – 2,01 pg), lo que sugiere la misma ploidía del ADN (Suda et al., 2006). La uniformidad que encontramos es consistente con evaluaciones realizadas sobre otras 20 poblaciones de T. crinita originarias del centro-oeste de Argentina, donde todas presentaron el mismo nivel de ploidía (2n = 4x = 40) (Kozub et al., 2019). Cabe destacar, que en el presente trabajo ampliamos la evaluación hacia poblaciones del sector disyunto norte de la distribución de la especie. Hasta la fecha no existía un estudio comparativo de este tipo entre poblaciones de ambos subcontinentes.
Considerando que como se dijo, T. crinita habita en Norteamérica y Sudamérica, en ambientes con ciertas diferencias climáticas (Quiroga et al., 2018), nuestros resultados contrastan con lo hallado por Hunter et al. (2001) y por De Silva y Snaydon (1995) en otras especies. Hunter et al. (2001) observaron en Larrea tridentata variación en el nivel de ploidía asociadas a las restricciones ambientales de los sitios habitados por la especie: poblaciones diploides tendían a predominar en ambientes relativamente más benignos (desierto de Chihuahua), mientras que poblaciones con mayores niveles de ploidía tendían a predominar a niveles crecientes de restricción ambiental (tetraploides en el desierto de Sonora, hexaploides en el desierto de Mojave). Por su parte, De Silva y Sandon (1995) encontraron que poblaciones tretraploides de Cynodon dactilon predominaban en ambientes con suelos de pH neutro (> 6,5) mientras que poblaciones diploides lo hacían en suelos de pH ácido (< 5). Cabe aclarar que si bien variaciones intraespecíficas en el nivel de ploidía traen por lo general aparejadas adaptaciones diferenciales en las plantas (Lučanová, 2019), no ocurre siempre lo mismo en sentido inverso: que poblaciones adaptadas a diferentes ambientes tengan necesariamente distinto nivel de ploidía. Esto porque las adaptaciones de distintos genotipos o poblaciones dentro de una especie pueden deberse a cambios genéticos ocurridos a otros niveles jerárquicos, sin que ocurra cambio de nivel de ploidía (Husband et al., 2013). De hecho, nuestros resultados que muestran niveles de ploidía uniformes entre poblaciones de T. crinita parecen no ser una excepción, dado que Wood et al. (2009) reportaron que sólo el 12–13% de las especies de plantas angiospermas evaluadas presentan variación intraespecífica en el nivel de ploidía.
Desde el punto de vista aplicado, que no se hayan detectado variaciones en el nivel de ploidía entre poblaciones de una misma región, o de ambas regiones de su distribución disyunta (Sudamérica, Norteamérica), sumado al hecho de que la especie ha sido definida como autocompatible y autógama (Gutiérrez et al., 2016; Kozub et al., 2017), brinda un panorama amplio de posibilidades de uso del germoplasma en planes de restauración (Kramer et al., 2018). Por ejemplo, para introducir materiales donde la presencia de la especie ha sido fuertemente diezmada, o utilizar mezclas de materiales de distintos orígenes para aminorar el efecto de variaciones climáticas e incrementar el potencial evolutivo (Broadhurst et al., 2008). Sin embargo, a pesar de tener el mismo nivel de ploidía, estudios poblacionales de T. crinita en Sudamérica mostraron variación en marcadores neutrales de AFLPs que a su vez se correlacionaron con características de importancia agronómica (Cavagnaro et al., 2006). Por lo tanto, integrar información de distintos marcadores de base genética podría aportar a orientar medidas de manejo, conservación y restauración.
CONCLUSIONES
No se encontraron diferencias en el contenido de ADN nuclear entre poblaciones de Trichloris crinita de Sudamérica y Norteamérica, tampoco entre poblaciones dentro de cada subcontinente. Los resultados sugieren que las poblaciones evaluadas presentan el mismo nivel de ploidía. Los resultados obtenidos en el presente estudio proporcionan datos de referencia sobre el contenido de ADN nuclear de T. crinita en Sudamérica y Norteamérica, y generan una plataforma para futuros trabajos de CMF. Se considera importante poder realizar análisis complementarios mediante técnicas citogenéticas que permitan profundizar sobre la naturaleza poliploide de T. crinita.
AGRADECIMIENTOS
A quienes contribuyeron a la colección de materiales vegetales, Pedro Ramón Namur, Sebastián Mora, Gladys Chilo, Lisandro Blanco, Victor Burghi, Antonio Prataviera, David Anderson, Forrest Smith.
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