Introducción

La agricultura del siglo XXI se enfrenta a múltiples retos, tiene que producir más alimentos y fibras a fin de satisfacer a una población creciente que incrementará en más de un tercio para el año 2050 (Andrade, 2016).

La nueva demanda de productos agrícolas ejercerá, por lo tanto, una presión creciente sobre los ya escasos recursos (FAO, 2017). La agricultura se verá forzada a competir por las tierras y el agua, pero además tendrá otros importantes frentes: deberá adaptarse al cambio climático, contribuir a la mitigación del mismo, ayudar a preservar los hábitats naturales y a conservar la biodiversidad (Andrade, 2016). En este contexto, es fundamental un cambio que garantice la permanencia de los recursos naturales y satisfaga las necesidades básicas de la población.

Una de las maneras de mitigar los desequilibrios producidos en el medio ambiente agrícola es mantener la cobertura vegetal (Andrade, 2017), lo que podría incluir la rotación de cultivos con presencia de leguminosas (Yuan y col., 2016; Yu y col., 2020).

La alfalfa es un cultivo perenne, con una vida útil de tres a cinco años. Esta condición genera un hábitat favorable para un gran número de artrópodos, entre los cuales se encuentran especies herbívoras, saprófagas, fungívoras, controladores biológicos y polinizadores, entre otros (Pons y Núñez, 2020). En Argentina, Villaverde y col., 2009 registraron en este cultivo 139 especies de insectos, pertenecientes mayoritariamente al Orden Hemiptera, Suborden Sternorrhyncha y a los Ordenes Coleoptera, Lepidoptera y Orthoptera. En la Región del Sudoeste bonaerense las especies de áfidos más frecuentes son el pulgón verde de la alfalfa, Acyrthosiphon pisum (Harris 1776), el pulgón negro de las leguminosas, Aphis craccivora (Koch 1854), y el pulgón manchado de la alfalfa, Therioaphis trifolii (Monell 1882) (Bizet Turovsky y col., 2017). Los insecticidas sintéticos han sido considerados un componente esencial para el control de estos áfidos (Nikolova y Georgieva, 2020). A pesar de los beneficios inmediatos en el control, a largo plazo han surgido problemas como resultado de su uso desmedido (Simon y Peccoud, 2018). En primer lugar, han contaminado el medio ambiente debido a que son sustancias de difícil degradación y, algunas, bioacumulables (Boudh y Singh, 2019). En segundo lugar, su falta de selectividad ha ocasionado la eliminación de la entomofauna benéfica y la aparición de plagas secundarias (Khan y Alhewairini, 2019). En tercer lugar, su toxicidad hacia los mamíferos ha generado un peligro potencial para la salud humana (Boudh y Singh, 2019). En cuarto lugar, su uso indiscriminado ha generado el desarrollo de fenómenos de resistencia en los insectos plagas, transformándose así en una de las principales barreras que reducen la eficiencia en el control de los insecticidas (Bass y col., 2014). Este fenómeno ha proliferado exponencialmente, para constituir hoy día una consideración indispensable en todos los programas de control de plagas (Simon y Peccoud, 2018). Las desventajas citadas anteriormente nos llevan a evaluar otros métodos alternativos de control como son los aceites esenciales (AE) (Mossa, 2016). Estos productos presentan alta selectividad, baja persistencia ambiental, baja toxicidad en mamíferos y una rápida acción (Toledo y col., 2020). Además, tienen especial interés debido a que podrían retrasar la aparición de resistencia, ya que están constituidos por una mezcla de varios compuestos con distintos modos de acción (Pavela y Benelli, 2016). Los AE de Eucalyptus globulus Labill. y de Mentha x piperita L. han demostrado tener un efectivo control sobre una amplia gama de insectos plaga (Kumar y col., 2011; Dhakad y col., 2018).

El objetivo de este trabajo fue evaluar la actividad insecticida y las alteraciones en la fecundidad producida por los AE de E. globulus y de M.. piperita en adultos de tres especies de áfidos plaga del cultivo de alfalfa.

Materiales y métodos

Insectos: Se utilizaron adultos ápteros de A. pisum,A. craccivora . T. trifolii provenientes de colonias criadas en el laboratorio de Zoología Agrícola, Dpto. de Agronomía de la Universidad Nacional del Sur. Para cada especie, la población fue establecida a partir de hembras ápteras virginóparas recolectadas de una parcela experimental de M. sativa ubicada en el predio del Campus de la Universidad Nacional del Sur (38°41’48,70” S, 62°14’58,38” O). Los insectos fueron criados sobre plantas de M. sativa cv. Monarca en condiciones controladas de temperatura y humedad relativa (24±1ºC y 65±10 % HR) con un fotoperiodo 12:12 (L:O).

Material vegetal: Las semillas del cv. Monarca fueron provistas por el Instituto Nacional de Tecnología Agropecuaria (INTA – Red de Evaluación de Alfalfa) y sembradas individualmente en macetas de 10 cm de diámetro con un suelo Haplustol éntico.

Aceites esenciales: Los AE comerciales de E. globulus y de M.. piperita fueron producidos por Swiss-Just Lomas del Mirador, Argentina; manufacturados bajo la supervisión y el control de Ulrich-Jüstrich AG Walzenhausen, Suiza. Las soluciones de los AE fueron preparadas disolviendo los mismos en agua destilada conteniendo una solución de Tween 20% (v v^-1).

Por otra parte, estos AE fueron analizados por Cromatografía Gaseosa y Espectrometría de Masas (CG-EM HP5972A) en una columna (HP5-MS 30 m x 0,25 mm x 0,25 μm) con un programa de temperaturas de 50ºC durante 3 minutos, una rampa de 5ºC/min y temperatura final de 200ºC durante 5 minutos. Los compuestos determinados para los AE y sus porcentajes relativos se muestran en la Tabla 1.

Tabla 1 / Table 1

Composición de los aceites esenciales de E. globulus y M. x piperita. / Composition of E. globulus and M. x piperita essentials oils.

Toxicidad por inmersión: Se evaluó según el método propuesto por la FAO (FAO, 1970). 10 áfidos adultos se dispusieron en el interior de un cilindro de vidrio (20 mm de diámetro por 30 mm de altura) cuyo fondo estaba cubierto con una gasa asegurada con una banda elástica. Este cilindro se sumergió durante 10 s en una cubeta que contenía 2 ml de las soluciones de los AE. Como control los áfidos se sumergieron en una solución de 0,2 ml de Tween 20% en agua destilada. Los áfidos se colocaron sobre las hojas. Se realizaron tres réplicas por concentración y por AE. Se registró la mortalidad luego de 1, 6 y 24 horas.

Toxicidad por contacto: Para evaluar la toxicidad por contacto se usaron plantas infestadas con 10 áfidos adultos. Utilizando un micropulverizador manual se aplicaron 0,2 ml de las soluciones de los AE. Como control se pulverizó con una solución de 0,2 ml de Tween 20% en agua destilada. Para evitar el parasitismo o el escape las plantas fueron confinadas en tubos de vidrios cubiertos con malla antiáfidos en su extremo. Se realizaron tres réplicas por concentración y por AE y cada experimento se repitió tres veces en forma independiente. Se registró la mortalidad a las 24 y 48 horas.

Efecto de los AE sobre la reproducción: Para este ensayo, 10 plantas fueron infestadas con una hembra adulta áptera de 24 horas de edad. Utilizando un micropulverizador manual se aplicaron 0,2 ml de una concentración igual a la CL₂₅ del AE obtenida en el ensayo de toxicidad por contacto. Se realizaron tres réplicas por AE. Para el control se utilizaron 0,2 ml de Tween 20% en agua destilada. Las plantas se cubrieron utilizando los tubos descriptos en el ensayo de toxicidad por contacto. Se registró diariamente el número de ninfas paridas por hembra durante siete días.

Análisis estadístico: Para los ensayos de toxicidad por inmersión y por contacto se estimaron los valores de CL₅₀ (concentración de un AE que controla el 50% de la población) mediante el programa SPSS 15.0. Para comparar los valores de CL₅₀ se utilizó el criterio de la no superposición de sus intervalos de confianza del 95% (NSIC, p < 0,05).

Los resultados del ensayo de reproducción se analizaron mediante la prueba de varianza ANOVA, previa verificación de los supuestos de normalidad con el test de Shapiro-Wilks y de homocedasticidad con la prueba de Levene (Di Rienzo y col., 2017) y las medias fueron separadas mediante el test de diferencias mínimas significativas (DMS, p ≥ 0,05).

Resultados

Toxicidad por inmersión: Los AE evaluados resultaron tóxicos para las tres especies de áfidos (Tabla 2). Durante el ensayo, para A. pisum . A. craccivora no se observaron diferencias en la toxicidad entre los AE (NSIC, p ≥ 0,05). Sin embargo, el AE de M. . piperita presentó una mayor actividad insecticida sobre A. pisum, mientras que el AE de E. globulus fue más tóxico para A. craccivora. Por otro lado, para T. trifolii el AE de M. . piperita resultó significativamente más tóxico durante el ensayo (NSIC, p < 0,05).

Tabla 2 / Table 2

Toxicidad por inmersión de los aceites esenciales sobre A. pisum, A. craccivora y T. trifolii; CL50: concentración letal 50 (% p v-1); IC 95%: intervalo de confianza del 95%. Para cada tiempo de evaluación, valores de CL50 seguidos por la misma letra no difieren significativamente (NSIC, p ≥ 0,05). / Immersion toxicity of essentials oils on A. pisum, A. craccivora and T. trifolii; LC50: lethal concentration 50 (% w v-1); 95% CL: 95% confidence intervals. Within each evaluation time, LC50 values followed by the same letter are not significantly different (NSIC, p ≥ 0,05).

Al evaluar la actividad insecticida del AE de E. globulus sobre los áfidos plaga se observó que a la 1h y a las 6h fue más tóxico para A. craccivora, diferenciándose significativamente de las otras especies (NSIC, p < 0,05). A las 24 horas, este AE resultó más tóxico para A. craccivora sin hallarse diferencias significativas con A. pisum (NSIC, p < 0,05) (Figura 1).

Figura 1 / Figure 1
Toxicidad por inmersión del aceite esencial de E. globulus. Para cada tiempo de evaluación, valores de CL50 seguidos por la misma letra no difieren significativamente (NSIC, p ≥ 0,05). / Immersion toxicity of E. globulus essential oil. Within each evaluation, time LC50 values followed by the same letter are not significantly different (NSIC, p ≥ 0,05)

Al considerar el efecto tóxico del AE de M. . piperita se observó que a la 1h presentó mayor toxicidad para A. craccivora, diferenciándose significativamente de T. trifolii (NSIC, p < 0,05). A las 6h fue más tóxico para A. pisum . A. craccivora que para T. trifolii (NSIC, p < 0,05). Al cabo de 24 horas, la toxicidad fue similar para las tres especies (NSIC, p ≥ 0,05) (Figura 2).

Figura 2 / Figure 2
Toxicidad por inmersión del aceite esencial de M. x piperita. Para cada tiempo de evaluación, valores de CL50 seguidos por la misma letra no difieren significativamente (NSIC, p ≥ 0,05). / Immersion toxicity of M. x piperita essential oil. Within each evaluation, time LC50 values followed by the same letter are not significantly different (NSIC, p ≥ 0,05).

Toxicidad por contacto: Al evaluar la toxicidad por contacto de los AE sobre los áfidos no se hallaron diferencias significativas durante todo el ensayo (Tabla 3). Para A. pisum el AE de E. globulus fue más tóxico a las 24 horas, mientras que el de M. . piperita fue el más letal a las 48 horas. Para A. craccivora, el AE de E. globulus fue más tóxico en todo el ensayo. Mientras que, para T. trifolii el AE de M. . piperita fue más letal tanto a las 24 como a las 48 horas.

Tabla 3 / Table 3

Toxicidad por contacto de los aceites esenciales sobre A. pisum, A. craccivora y T. trifolii; CL50: concentración letal 50 (% p v-1); IC 95%: intervalo de confianza del 95%. Para cada tiempo de evaluación, valores de CL50 seguidos por la misma letra no difieren significativamente (NSIC, p ≥ 0,05). / Contact toxicity of essentials oils on A. pisum, A. craccivora and T. trifolii; LC50: lethal concentration 50 (% w v-1); 95% CL: 95% confidence intervals. Within each evaluation time, LC50 values followed by the same letter are not significantly different (NSIC, p ≥ 0,05).

Al analizar los valores de la CL₅₀ obtenidos a las 24 horas se observó que el AE de E. globulus fue más letal para T. trifolii, diferenciándose estadísticamente de A. craccivora (NSIC, p < 0,05). Mientras que el AE de M. . piperita fue significativamente más tóxico para T. trifolii (NSIC, p < 0,05) (Figura 3).

Figura 3 / Figure 3
Toxicidad por contacto de los aceites esenciales a las 24 horas. Para cada aceite esencial, valores de CL50 seguidos por la misma letra dentro de no difieren significativamente (NSIC, p ≥ 0,05). / Contact toxicity of the essentials oils at 24 hours. Within each essential oil, LC50 values followed by the same letter are not significantly different (NSIC, p ≥ 0,05).

Luego de 48 horas el AE de E. globulus produjo una toxicidad estadísticamente similar para las tres especies de áfidos (NSIC, p ≥ 0,05). Por su parte, el AE de M. . piperita fue más efectivo para el control de A. pisum . T. trifolii (NSIC, p < 0,05) (Figura 4).

Figura 4 / Figure 4
Toxicidad por contacto de los aceites esenciales a las 48 horas. Para cada aceite esencial, valores de CL50 seguidos por la misma letra dentro de no difieren significativamente (NSIC, p ≥ 0,05). / Contact toxicity of the essentials oils at 48 hours. Within each essential oil, LC50 values followed by the same letter are not significantly different (NSIC, p ≥ 0,05).

Efecto sobre la reproducción: para A. pisum, a las 24 horas luego del tratamiento el promedio de ninfas paridas no difirió significativamente del control para ambos AE (DMS, p ≥ 0,05). A partir del segundo día de realizarse la pulverización hasta el séptimo día de evaluación los AE se diferenciaron significativamente del control (DMS, p < 0,05), produciéndose una disminución en el porcentaje de ninfas nacidas que osciló entre el 30 y el 60% para E. globulus y entre el 30 al 41% para M. x piperita para cada fecha evaluada (Figura 5a).

El porcentaje de parición de A. craccivora disminuyó entre un 42 y un 60% en las plantas tratadas con el AE de E. globulus. Para las plantas pulverizadas con M. . piperita el porcentaje de disminución de la parición para cada fecha osciló entre el 26 y el 55 %. Durante todo el ensayo el número de ninfas paridas en plantas tratadas con los AE se diferenció significativamente del control (DMS, p < 0,05) (Figura 5b).

Al utilizar el AE de E. globulus se observó que el promedio de ninfas paridas por T. trifolii disminuyó entre un 26 y un 56% con respecto al control. Al tratar las plantas con el AE de M. . piperita se observó una disminución de entre el 31 al 46 % (Figura 5c).

Figura 5 / Figure 5
Promedio de ninfas paridas (± error estándar) de A. pisum, A. craccivora y T. trifolii expuestos a los aceites esenciales de E. globulus y M x piperita. Para cada día, valores seguidos por la misma letra no difieren significativamente (DMS, p ≥ 0,05). / Mean number (± standard error) of A. pisum, A. craccivora and T. trifolii offspring expose to E. globulus and M x piperita essentials oils. Whitin each day, values followed by the same letter are not significantly different (DMS, p ≥ 0,05).

Discusión y conclusiones

Los AE afectan a los insectos y otros artrópodos de diversas maneras dependiendo del tipo de planta de la cual se extraen y de las características fisiológicas de las especies plagas (Hikal y col., 2017).

La actividad insecticida de los AE se basa en las concentraciones de los componentes mayoritarios que pertenecen a la clase de los terpenos, fenoles y alcaloides (Moghaddam y Mehdizadeh, 2017).

En nuestro trabajo las actividades insecticidas de los AE de E. globulus y de M. . piperita variaron de acuerdo a los tiempos de evaluación y al tipo de bioensayo utilizado para registrar la mortalidad de los áfidos plaga.

Los AE de E. globulus y de M. . piperita produjeron mortalidad tanto por inmersión como por contacto. Similares resultados fueron obtenidos por otros autores al utilizar AE de diferentes plantas sobre los áfidos A. pisum, A. craccivora . T. trifolii (Kassimi y El Watik, 2012; Kassimi y col., 2016).

Cuando los insectos fueron sumergidos en los AE las sustancias tóxicas entraron en contacto con la cutícula y difundieron a través de ella en forma vertical y horizontal. En este tipo de exposición la lipofilicidad de las sustancias es un factor importante en la determinación de la toxicidad (Hikal y col., 2017; Rizvi y col., 2018).

En nuestros ensayos tanto a la hora, como a las seis y a las 24 horas el AE de M. . piperita fue el más efectivo para el control de T. trifolii. Esto podría deberse a la presencia de distintos metabolitos secundarios con una alta lipofilicidad o a diferencias en la concentración de estos metabolitos (Rizvi y col., 2018).

En el ensayo de toxicidad por contacto los AE evaluados produjeron menos toxicidad para A. craccivora. Esta diferencia en la sensibilidad entre los áfidos a los AE podría ser el resultado de las distintas adaptaciones a la herbivoría (Digilio y col., 2008). A. craccivora presenta un amplio rango de huéspedes (Blackman y Eastop, 2007) y está asociado con la habilidad de superar diferentes tipos de defensas en las plantas (Bass y col., 2013).

Cabe destacar que la CL₅₀ hallada tanto para los ensayos de inmersión como para los ensayos de toxicidad por contacto fueron menores que las informadas para el AE de M. . piperita sobre Lipaphis pseudobrassicae (CL₅₀: 8,8 mg ml^-1) (Sampson y col., 2005) y para el AE de M. microphylla por inmersión sobre A. craccivora (CL₅₀: 0,50 mg ml^-1) (Farghaly y col., 2009).

Algunos estudios han reportado los efectos subletales de los AE y de sus componentes sobre la biología de los insectos. Algunos AE que actúan sobre el sistema endocrino pueden también influir en el comportamiento reproductivo (de França y col., 2017). En nuestro trabajo se observó una disminución en la fecundidad diaria de los áfidos expuestos a los AE. Los áfidos se alimentan pasivamente de savia floemática, pero ante condiciones de estrés como cambios en la calidad del alimento, la presencia de metabolitos secundarios o cambios endocrinos relacionados con el sistema reproductivo comienzan a ingerir savia xilemática a fin de reestablecer el balance hídrico (Daniels y col., 2009). En este contexto la reproducción se vería afectada de manera negativa. En este estudio la aplicación de AE en las plantas de M. sativa podría ocasionar un cambio en la calidad del alimento en detrimento de la reproducción. Una disminución en la fecundidad fue observada por Tomova y col. (2005) al evaluar el AE de Tagetes minuta en A. pisum y por Ofuya y Okuku (1994) al evaluar extractos acetónicos de Zingiber officinalis . Aframomum melegueta en A. craccivora.

En base a los resultados obtenidos podemos concluir que ambos AE presentaron toxicidad por inmersión, toxicidad por contacto y disminución de la progenie de los áfidos criados sobre plantas de M. sativa tratadas. Estos aceites podrían ser utilizados en un ecosistema agrícola como una herramienta sustentable y de bajo impacto ambiental.

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