Estudio comparativo del metabolismo del carbono en autótrofos y heterótrofos. Caracterización de enzimas de diatomeas y sus relaciones evolutivas con otros organismos

Abstract

Las diatomeas son algas cromófitas capaces de crecer en agua salada y dulce, bajo condiciones extremas de temperatura y salinidad, en forma autótrofa, heterotrófica o mixta. El modelo experimental dentro de las diatomeas es Phaeodactylum tricornutum, que tiene genoma pequeño, tiempo de generación corto y es factible de ser transformada genéticamente. En esta tesis se presentan estudios realizados sobre la caracterización funcional, estructural y regulatoria de la enzima fosfoglicerato quinasa-1 de P. tricornutum, presentando características distintivas con respecto a enzimas de otros organismos. Por otro lado, se midió actividad enzimática in vivo de la enzima responsable de la síntesis del crisolaminarán (crisolaminarán sintasa), identificando su sustrato glucosídico y aportando así información a esta vía metabólica tan escasamente caracterizada. También se intentó purificar la enzima UDP-glucosa pirofosforilasa de P. tricornutum a partir de células de la diatomea y se logró identificar su secuencia e inferir sobre la localización de la síntesis del polisacárido de reserva. Finalmente, se realizó la medida de actividades enzimáticas de proteínas involucradas en el metabolismo de hidratos de carbono en extractos de diatomeas crecidas bajo condiciones. Así, se logró establecer un escenario metabólico ocurrente e identificar las vías puestas en marcha en presencia de fuentes de carbono y nitrógeno externas o de agentes oxidantes. En conjunto, los resultados del presente trabajo de tesis representan un aporte a la comprensión de las diatomeas a nivel metabólico y molecular, y a su comparación con otros organismos fotosintéticos y/o heterotróficos relacionados, dada su importante ubicación en el contexto evolutivo.

Diatoms are a group of cromophyte algae capable of growing autotrophically, heterotrophically and mixotrophically in sweet and salty water, even under extreme temperature and salinity conditions. Phaeodactylum tricornutum is the most widely used model system for studying diatoms because of its small genome, short generation time and ease of genetic transformation. In this thesis, studies were made on functional, structural and regulatory characterization of P. tricornutum phosphoglycerate kinase-1, which resulted in distinctive features when comparing with other organisms enzymes. On the other hand, enzymatic activity of the enzyme responsible of chrysolaminaran synthesis – chrysolaminaran synthase – was measured in vivo, and its glycosyl donor was identified. These results contribute to the knowledge of the chrysolaminaran synthesis pathway, scarcely studied so far. Also, UDP glucose pyrophosphorylase from P. tricornutum cells was partially purified and the identification of its sequence was achieved, which allowed us to infer about the reserve polysaccharide synthesis localization. Finally, enzymatic activities of proteins involved in carbohydrates metabolism in diatoms grown under two different conditions were measured. Thus, we have presented an active metabolic scenery in these microorganisms and have identified the operating pathways in cells grown in presence of carbon and nitrogen sources or oxidizing agents. This backdrop represents a contribution for future studies that will allow a bigger comprehension of diatoms at the metabolic and molecular levels and the establishment of evolutionary relationships with other photosynthetic and/or heterotrophic organisms.