Desarrollo de sistemas de diagnóstico para la hormona estimulante de tiroides (TSH) en suero humano: ELISA e Inmuno-PCR cuantitativa (qIPCR)

Abstract

La función de la glándula tiroides está regulada por la hormona estimulante de la tiroides (TSH). Dado que el control por retroalimentación de la secreción de TSH es exquisitamente sensible a las hormonas tiroideas periféricas, la mayoría de los trastornos tiroideos pueden diagnosticarse midiendo los niveles de TSH y de las hormonas tiroideas. Por esta razón, la medición de TSH en suero humano ha sido establecida como la "primera línea" para el diagnóstico de la función tiroidea. En este trabajo de tesis desarrollamos un ensayo de ELISA sandwich y uno de IPCR altamente sensible, específicos para la detección de la hormona estimulante de la tiroides humana (hTSH). Se generó un panel de anticuerpos monoclonales contra hTSH y se seleccionaron combinaciones de anticuerpos. Dos prototipos de ELISA (B-4 y B-9) se evaluaron frente a patrones calibrados con la 2ª preparación internacional de referencia de la Organización Mundial de la Salud y en comparación con un kit ELISA comercial. Seleccionamos el ELISA B-9 para desarrollar el ensayo de IPCR, utilizando el formato "Universal", en tubos de PCR estándar sin pretratamiento. En comparación con los ELISAs evaluados, el ensayo de IPCR mostró un menor límite de detección y un considerable aumento de la sensibilidad, proporcionando una mejor resolución cuantitativa en el rango de bajas concentraciones de la hormona. La sensibilidad, facilidad de uso y el bajo costo de la técnica IPCR desarrollada ubican a esta metodología como una plataforma potencial para la detección cuantitativa de hTSH en muestras de suero humano.

Thyroid gland function is regulated by the thyroid stimulating hormone (TSH). Because feedback control of TSH secretion by peripheral thyroid hormones is sensitive, most thyroid disorders can be diagnosed by measuring basal TSH and thyroid hormone levels. Thus, measurement of TSH in human fluids is utilized as a “first line” thyroid test, in order to assist clinical decision-making. In this work, we developed a conventional enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) and a highly sensitive immuno-polymerase chain reaction (IPCR) assay specific for detection of human thyroid stimulating hormone (hTSH). Several anti-hTSH monoclonal antibodies (MAbs) were generated using hybridoma technology. The ELISA prototypes were evaluated with standards calibrated with WHO 2nd International Reference Preparation for hTSH and in comparison with a commercial ELISA Kit. We selected the B-9 ELISA to develop a hTSH-IPCR assay applying an “Universal-IPCR” format in standard PCR tubes without pretreatment. The hTSH-IPCR assay showed a lower LOD and a highest sensitivity in terms of the slope definition of sensitivity, providing better quantitative resolution for a given amount of measurement error. The sensitivity, ease of use, and low cost of IPCR support this technique as a potential platform for the detection of hTSH hormone in serum samples. Our results support the potential of IPCR technique for being applied in diagnosis of thyroid states and for reliable measurement of low clinically relevant human TSH levels. Therefore, we consider that the proposed method has exhibited great potentiality and could act as a good tool for hormone analysis.