Clonado, expresión y caracterización molecular y fisicoquímica de enzimas involucradas en la etapa de desnitrificación del ciclo del nitrógeno

Abstract

La nitrito reductasa de cobre (NirK) cataliza la reducción de NO2- a NO en la desnitrificación. Estas enzimas se clasifican por sus propiedades espectroscópicas en verdes y azules. Las NirK presentan en su estructura dos sitios de cobre denominados T1Cu y T2Cu que funcionan como sitio de transferencia electrónica (TE) y sitio activo, respectivamente. El mecanismo de reacción propuesto implica una reacción redox acoplada a dos protones en la cual el nitrito, después de unirse al T2Cu, es convertido a NO por medio de un electrón que proviene del T1Cu. El centro de transferencia recibe el electrón desde un dador fisiológico externo y lo transfiere por medio del puente Cys-His al sitio activo. El puente Cys-His es un camino de TE compuesto por dos subcaminos de TE potenciales. Este trabajo se desarrolló a partir del estudio de una NirK verde de Sinorhizobium meliloti 2011 (SmNirK) y otra azul aislada de Bradyrhizobium japonicum USDA 110 (BjNirK). El objetivo principal fue estudiar el mecanismo catalítico mediante caracterización molecular, espectroscópica (EPR y UV-vis) y electroquímica de las enzimas y sus dadores. Mediante estudios de EPR se verificó que los potenciales de reducción de los centros son modulados como consecuencia de su interacción con el dador electrónico fisiológico para favorecer la TE intraproteína. La TE intraproteína se estudió mediante mutagénesis sitio dirigida del puente Cys-His en SmNirK, estudios estructurales in silico y estudios dependientes del pH en ambas NirK. Independientemente del color de las enzimas, la TE intraproteína ocurre por una misma vía estructural.

Copper nitrite reductase (NirK) is an enzyme that catalyzes the reduction of NO2- to NO in the denitrification process. These enzymes are classified in green and blue according to their spectroscopic properties. They present two copper sites called T1Cu and T2Cu which are the electron transfer (ET) site and the active site, respectively. The proposed reaction mechanism for Nirs implies a two-proton coupled redox reaction in which nitrite, after binding T2Cu, is converted to NO by one electron delivered to T1Cu by an external physiological electron donor through the Cis-His bridge. The Cys-His bridge is an electron transfer pathway having two potential ET subpathways. In this work a green NirK from Sinorhizobium meliloti 2011 (SmNirK) and a blue enzyme from Bradyrhizobium japonicum USDA 110 (BjNirK) were studied. The main objective was to study the catalytic mechanism of both enzymes characterizing the molecular, spectroscopic and electrochemical properties of both enzymes and their physiological electron donors. EPR studies show that the reduction potentials of the metal centers of SmNirK are modulated by the interaction with the physiological electron donor to favor intraprotein ET. The intraprotein ET process was studied by site-directed mutagenesis changing the amino acids of the Cis-His bridge of SmNirK, in silico structural studies and pH-dependent studies in both NirK. Regardless of the color of the enzymes, intraprotein ET occurs through the same structural subpathway.