Estudio de la diversidad genética en poblaciones de Babesia bigemina de diferentes regiones geográficas.

Abstract

La babesiosis bovina es una enfermedad enzoótica causada por protozoarios Apicomplexa del género Babesia. En Argentina, esta enfermedad es provocada por B. bovis y B. bigemina, ambas trasmitidas por la garrapata Rhipicephalus microplus. La caracterización molecular de B. bigemina permitiría realizar estudios epidemiológicos, desarrollar pruebas para diagnóstico y sintetizar vacunas. En este trabajo se seleccionaron clones biológicos a partir de una cepa patógena y una cepa atenuada de B. bigemina, ambas adaptadas a la multiplicación continua in vitro, utilizando diluciones límite. Estos clones fueron útiles para establecer la constitución genética de aislamientos y cepas de referencia, comparar clones con diferente fenotipo de virulencia, evaluar marcadores moleculares, y caracterizar aislamientos silvestres. Se compararon los genes 18S rARN, rap1c y gp45 y las regiones intergénicas ITS y diferentes secuencias repetitivas en clones y cepas silvestres. El gen gp45 no pudo utilizarse debido a la falta detección en una cepa y las regiones ITS mostraron elevado polimorfismo. Sólo 3 ms y 1 MS permitieron diferenciar clones con diferentes genotipos. Estos marcadores permitieron agrupar clones y cepas por su fenotipo de virulencia. El análisis de las secuencias de los genes 18S rARN y rap1c de los clones biológicos, confirmó que ciertas subpoblaciones de Babesia prevalecen durante la adaptación in vitro. En conclusión, los clones y los marcadores moleculares seleccionados permitieron establecer la diversidad existente entre cepas obtenidas de diferentes regiones de Argentina y de otros países. Este trabajo establece la base para definir la importancia de la patogenia de B. bigemina en infecciones naturales.

Bovine babesiosis is an enzootic disease caused by Apicomplexa protozoa from Babesia genus. In Argentine, the etiological agents are Babesia bovis and Babesia bigemina, both transmitted by Rhipicephalus microplus. Studying the biology and the intraespecific genetic variations of B. bigemina from Argentinean and other region strains has become an easy task after the development of continuous in vitro multiplication for these parasites. The studies were based on the use of strains and clones which patogenicity level was established in vivo. Clones were obtained by the limiting dilution technique and showed similar in vitro multiplication efficiency and the same phenotype as their parental strains. 18S rRNA, rap1c, gp45, ITS genes and repeat sequences were compared. The 18S rRNA gene allowed strains differentiation by using punctual mutations visualized in the secondary structure of E23-1 helix. Individually, rap-1c gene was used to identify strains associated to patogenicity, confirmed with HRM technique. Differences existing between not geographically related strains were identified by using 18S rRNA and repeat sequences. Finally, the population selection after the strains adaptation to the in vitro growth was confirmed through the simultaneous analysis of 18S rRNA and rap1c sequences from clones. As a conclusion, clones and molecular markers selected allowed to establish the diversity among different Argentinean regions and among these and foreign strains. Differences between the virulence of the strains helped us to gain knowledge of the patogenicity from B. bigemina natural isolates.