Mecanismos de carga, selección y retención de hebras de micro ARNs en plantas

Abstract

Los micro ARNs (miARNs) regulan numerosos procesos durante el desarrollo de las plantas. ARGONAUTA 1 (AGO1), principal efector de la vía, carga los dúplex de miARN, en parte en el núcleo, y retiene sólo una de las hebras utilizándola como guía para reconocer y silenciar genes blanco. A fin de comprender con mayor profundidad los mecanismos de carga y selección de hebras de miARNs en AGO1, por un lado, logramos identificar a CARP9, una proteína nuclear intrínsecamente desordenada, como un factor que promueve la carga nuclear de miARNs en AGO1. Mutaciones en CARP9 provocan alteraciones en los niveles de miARNs y el silenciamiento génico, causando defectos morfológicos notables. CARP9 interacciona con HYL1, y se asocia a miARNs maduros, pero no a sus precursores. Además, CARP9 interacciona en el núcleo con AGO1. Mutantes carp9 presentan niveles reducidos de miARNs cargados en AGO1, retención parcial de miARNs en el núcleo, y niveles proteicos reducidos de AGO1. Estos resultados sugieren que CARP9 modula la comunicación HYL1-AGO1 en el núcleo, actuando como anclaje y promoviendo la carga de miARNs en el complejo RISC. Por otro lado, realizamos una búsqueda de factores candidatos a participar en los procesos que dictan la selección de la hebra de miARNs correcta por AGO1, mediante el diseño y la utilización de un sistema reportero que permite discernir qué hebra se carga en AGO1. Realizando mutagénesis al azar y secuenciación de genoma completo de plantas mutantes de interés, identificamos y analizamos preliminarmente potenciales genes candidatos a participar en dicho proceso.

MicroRNAs (miRNAs) regulate numerous processes during plant development. ARGONAUTA 1 (AGO1), the main effector of the pathway, loads miRNA duplexes and uses them as a guide to recognize and silence target genes. In order to study the mechanisms of loading and strand selection of miRNAs into AGO1 we took two approaches. We identified CARP9, an intrinsically disordered nuclear protein, as a factor that promotes nuclear loading of miRNAs in AGO1. Mutations in CARP9 lead to an alteration in miRNA levels and gene silencing, causing notable morphological defects. CARP9 interacts with HYL1, and is associated with mature miRNAs, but not with its precursors. Furthermore, CARP9 interacts in the nucleus with AGO1. Plants deficient in CARP9 displayed reduced levels of AGO1-loaded miRNAs, partial retention of miRNAs in the nucleus, and reduced protein levels of AGO1. These results suggest that CARP9 modulates HYL1-AGO1 crosstalk in the nucleus, acting as a scaffold and promoting the loading of miRNAs in the RISC complex. On the other hand, we performed a forward genetic screening searching for proteins potentially participating in miRNA-duplex strand selection by AGO1. For this, we designed and used a reporter system that allows us to discern which strand is loaded into AGO1. Performing random mutagenesis and whole genome sequencing of mutant plants of interest, we identified and preliminarily analyzed some candidate genes linked to these processes.