Caracterización funcional, cinética y estructural de enzimas involucradas en el metabolismo de azúcares-alcoholes y de rafinosa en plantas. Obtención de herramientas moleculares con aplicaciones en procesos biotecnológicos y de biorrefinerías

Abstract

Este trabajo de Tesis se centra en el estudio de las enzimas que intervienen en el metabolismo del manitol en plantas de apio (Apium graveolens) y de la rafinosa en plantas de Brachypodium distachyon. Se caracterizaron cinética y estructuralmente la manosa-6-fosfato reductasa y la manitol deshidrogenasa, enzimas clave para la síntesis y degradación del manitol, respectivamente, y la UDP-azúcar pirofosforilasa, la galactinol sintasa y la rafinosa sintasa, enzimas involucradas en la síntesis de rafinosa. La combinación de información estructural con datos bioquímicos permitió establecer relaciones estructura-función, en el contexto de los escenarios evolutivos y metabólicos en los que participan las enzimas estudiadas. Además, se obtuvieron nuevas versiones de dichas enzimas con especificidad alterada por el sustrato o el cofactor, lo que permite ampliar el espectro de reacciones que catalizan y los productos finales que se obtienen de ellas. Por lo tanto, las enzimas mutantes así generadas podrían ser empleadas para el agregado de valor, recuperación y aprovechamiento de sub-productos industriales mediante procesos biotecnológicos. Además, se crecieron plantas de apio bajo diferentes fotoperiodos (largo, normal y corto) y a baja temperatura, para estudiar el efecto de las condiciones ambientales sobre la partición del carbono en plantas de apio. De esta forma, logramos obtener un panorama más completo sobre la regulación de las diferentes rutas metabólicas involucradas en la utilización del carbono en plantas de apio y B. distachyon.

This Thesis work focuses on the study of enzymes involved in mannitol and raffinose metabolism in celery (Apium graveolens) and Brachypodium distachyon, respectively. Mannose-6-phosphate reductase and mannitol dehydrogenase, key enzymes for the synthesis and degradation of mannitol, respectively, and UDP-sugar pyrophosphorylase, galactinol synthase and raffinose synthase, enzymes involved in the synthesis of raffinose, were kinetically and structurally characterized. The combination of structural information with biochemical data led to the establishment of structure-function relationships, in the context of the evolutionary and metabolic scenarios in which the studied enzymes participate. In addition, new versions of these enzymes with altered specificity for the substrate or the cofactor were obtained, to broaden the spectrum of catalyzed reactions and their final products. The generated mutant enzymes could be used to increase the value and recovery of industrial by-products through biotechnological processes. Additionally, celery plants were grown under different photoperiods (long, normal, and short) and temperatures, to study the effect of environmental conditions on carbon partition in celery plants. These studies allowed us to obtain a better picture of the regulation of the different metabolic pathways involved in carbon utilization in celery and B. distachyon plants.