Caracterización estructural de la interacción de ligandos con la ADP-glucosa pirofosforilasa

Abstract

El principal paso regulador en la síntesis de glucógeno en bacterias y de almidón en plantas corresponde a la reacción catalizada por la enzima ADP-Glc PPasa. Siendo que la mayoría de las enzimas caracterizadas hasta el momento, están reguladas alostéricamente, se planteó como principal objetivo de la tesis dilucidar los mecanismos moleculares de esta regulación y ampliar el conocimiento de las interrelaciones entre los distintos efectores. Las enzimas estudiadas fueron las de E. coli y A. tumefaciens. Los resultados obtenidos mediante estudios cinéticos y de electroforesis capilar de afinidad de mutantes sitio-dirigidas de la enzima de E. coli, permitieron establecer el rol de ciertos loops en la propagación de la señal de activación desde el lugar de unión del activador alostérico al sitio activo. Estudios cinéticos realizados con la enzima de A. tumefaciens mostraron que sus dos activadores principales presentaron efectos cooperativos positivos mutuos en la etapa de unión y efectos no aditivos en la etapa catalítica. Se propuso un modelo de unión y en función del mismo se planteó una ecuación, cuyas velocidades teóricas se adecuaron perfectamente a los valores experimentales obtenidos para las distintas situaciones investigadas. El hallazgo de nuevos efectores sobre la enzima de A. tumefaciens en relación al metabolismo de la bacteria, permitió definir que la síntesis de glucógeno en este microorganismo, estaría regulada por los niveles de intermediarios claves de la vía glucolítica de Entner-Doudoroff en conexión con la ruta de las pentosas fosfato.

The major regulatory step in the synthesis of glycogen in bacteria and starch in plants corresponds to the formation of ADP Glc, catalyzed by the ADP-Glc PPase enzyme. As most of the enzymes are allosterically regulated by modulators, this thesis was conceived with the aim of expanding the knowledge of the interactions between the different effectors as well as to understand the molecular mechanism of allosteric regulation. The studies were performed on two bacterial enzymes, the E. coli and A. tumefaciens ADP Glc PPases. The results obtained by studying site-directed mutants of E. coli enzyme allowed us to establish the role of certain loops in the propagation of allosteric activation from the allosteric activator binding site to the active site. Kinetic studies with A. tumefaciens enzyme showed the existence of coupled effects between the two major activators, F6P and Pyr. Activators showed mutual positive cooperative effects in the binding step and non-additive effects in the catalytic step. A binding model was proposed and based on this model an equation was raised, whose theoretical speeds perfectly suited to the experimental values obtained from different investigated situations. Correlating the discovery of novel effectors with the metabolism of the bacteria, we can say that the allosteric regulation of the ADP Glc PPasa from A. tumefaciens, would be governed by the levels of intermediates of the Entner-Doudoroff glycolytic pathway in connection with the pentose phosphate route.