Caracterización cinética, regulatoria y estructural de enzimas involucradas en el metabolismo de polisacáridos de reserva en bacterias

Abstract

La acumulación de glucógeno ha sido bien caracterizada en bacterias Gram negativas. Se ha evidenciado que ADP-glucosa pirofosforilasa (ADP-GlcPPasa) cataliza el paso de la síntesis del donante de glicosilo para la elongación de glucógeno, siendo la enzima clave (regulada) en la ruta para la biosíntesis de glucógeno bacteriano. En cuanto a los microorganismos Gram positivos, la información disponible es escasa, y la comprensión de la ocurrencia y la regulación del metabolismo de polisacáridos es todavía incompleta. Las medidas relativas a la síntesis de glucógeno fueron aclarados en bacterias Gram-negativas y se estableció que el paso regulatorio clave está dado por la ADP-GlcPPasa, un enzima alostérica regulada por moléculas provenientes de la principal vía de asimilación de carbono en el organismo respectivo. El trabajo experimental de esta tesis se relaciona principalmente a estudios sobre la presencia y regulación de la síntesis de glucógeno en bacterias Gram positivas. El enfoque fue el clonado molecular y la caracterización de la ADP-GlcPPasa de: i) el grupo Firmicutes (bajo contenido de G + C), tomando como representativa la perteneciente al microorganismo Streptococcus mutans; y ii) aquellos organismos con alto contenido de G + C, en particular Streptomyces coelicolor y Mycobacterium tuberculosis. El aporte más relevante de este trabajo radica en establecer que la ADP-GlcPPasa en bacterias Gram positivas posee propiedades regulatorias y estructurales distintivas de las encontradas para la enzima de las bacterias Gram negativas, cianobacterias, algas verdes y plantas superiores. Además, en este trabajo se obtuvieron herramientas moleculares claves para futuros estudios sobre la relación estructura a funcion de las ADP-GlcPPase, permitiendo llegar a una comprensión más completa de las características distintivas de la enzima en las diferentes fuentes naturales.

The accumulation of glycogen has been relatively well characterized in Gram negative bacteria. It has been evidenced that ADP-glucose pyrophosphorylase (ADP-GlcPPase) catalyzes the step of synthesis of the glycosyl donor for glycogen elongation, being the key regulatory enzyme in the pathway for bacterial glycogen biosynthesis. Regarding Gram positive microorganisms, the available information is scarce, and the understanding of the occurrence and regulation of the polysaccharide metabolism is far from complete. The steps concerning glycogen synthesis were elucidated in Gram-negative bacteria and it was established that the committed step is given by the ADP-GlcPPase, an allosteryc enzymes regulated by molecules from to the main carbon assimilation route in the organism. The experimental work of this thesis mainly involved studies on the occurrence and regulation of glycogen synthesis in Gram positive bacteria. The focus was the molecular cloning and characterization of ADP-GlcPPase from: i) the Firmicutes group (low G+C content), which representative microorganism is Streptococcus mutans; and ii) those organisms with high G+C content, particularly the Streptomyces coelicolor and Mycobacterium tuberculosis. The most relevant contribution of this work relies in establishing that ADP-GlcPPase in Gram positive bacteria possesses regulatory and structural properties distinctive from those found for the enzyme from Gram negative bacteria, cyanobacteria, green algae and higher plants. Additionally, in this work they were obtained key molecular tools for future studies on structure regulation-relationship, allowing reaching a more comprehensive understanding of the distinctive characteristics of the enzyme in the different natural sources.