Caracterización molecular de integrones clase 1. Expresión y caracterización funcional de orfs asociados

Abstract

Como parte de un estudio epidemiológico realizado con anterioridad en nuestra región se ha detectado un nuevo gen de una beta-lactamasa (blaOXA-101) derivado de blaOXA-10, que se encuentra en un integrón de clase 1 en tres cepas multirresistentes de enterobacterias. En este estudio, hemos caracterizado la localización genética y la transferibilidad de blaOXA-101, así como sus características bioquímicas. Los resultados obtenidos confirman que este gen en casete se encuentra en un plásmido conjugativo de alto peso molecular. Además, se determinó el punto isoeléctrico y el peso molecular de la enzima recombinante purificada. Por último, se realizó una breve caracterización cinética. Se analizó la presencia de integrones clase 1 inusuales en aislamientos clínicos de enterobacterias recolectados en dos instituciones de salud en la ciudad de Santa Fe. En los integrones complejos detectados, se estudió la presencia de determinantes de resistencia a quinolonas (genes qnr) y β-lactámicos (blaCTX-M-2 y blaPER-2). Además, se realizó la caracterización molecular de los integrones insuales detectados. Por otro lado, se analizó la capacidad de interacción de Orf513 con diferentes secuencias de ADN, de manera de poder estudiar la hipótesis de que esta proteína posee actividad recombinasa y es capaz de movilizar genes contiguos al elemento ISCR1. Se realizaron ensayos de retardo de movilidad electroforética entre el extracto con la proteína en estudio y diferentes secuencias de ADN, obteniéndose evidencias de interacción entre Orf513 y secuencias de ADN particulares. De nuestro conocimiento, esta es la primera descripción realizada de la actividad enzimática postulada para Orf513.

As part of an epidemiological study previously conducted in our region it has been detected a new gene cassette coding for a beta-lactamase (blaOXA-101) derived from blaOXA-10, located in a class 1 integron in three multidrug resistant isolates of Enterobacteriaceae. In this study, we have characterized the genetic localization and transferability of blaOXA-101, and also the biochemical characteristics of this β-lactamase. The obtained results confirm that this gene cassette is located on to a high molecular weight conjugative plasmid. Also, it was determined the isoelectric point and molecular weight of the purified recombinant enzyme. Finally, a brief kinetic characterization was performed. The presence of complex class 1 integrons in clinical isolates of Enterobacteriaceae collected in two health institutions in Santa Fe city was analyzed. In the complex integrons detected, the existence of quinolone resistance determinants (qnr genes) and β -lactams (blaCTX-M-2 and blaPER-2) was studied. Finally, molecular characterization of certain regions of complex class 1 integrons was carried out. We examined the occurrence of protein-DNA interaction between Orf513 and different DNA sequences, so as to examine the hypothesis that this protein has recombinase activity and is able to mobilize adjacent genes to ISCR1 element. Electrophoresis mobility shifts assays were performed between the protein extract, containing Orf513, and several DNA sequences. The obtained data showed DNA-binding activity for a purified extract of Orf513 on particular DNA sequences. To the best of our knowledge, this is the first experimental description related to the proposed enzymatic activity for this protein.